張國偉，陳新新，田春雨*，馬雷雷，付文浩，李繼安，王自善，付常寬

1華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，唐山 063210；2清華大學(xué)醫(yī)院，北京 100084

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是由胰島素分泌不足或胰島素抵抗引起的碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪代謝失調(diào)的綜合癥，它是一種慢性內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，主要由長期高血糖引起。糖尿病主要分為1型和2型糖尿病(T2DM)，在最近的幾十年中，T2DM的全球患病率以驚人的速度持續(xù)增長，患病數(shù)量占DM患病總數(shù)的85%～95%。根據(jù)第九版全球糖尿病地圖最新數(shù)據(jù)顯示，截至2019年全世界約有4.63億糖尿病患者，中國為糖尿病患病人數(shù)最多的國家，約有1.164億糖尿病患者，預(yù)計(jì)2030年(1.405億)和2045年(1.472億)中國糖尿病患者數(shù)量仍居全球首位[1]。因此，開發(fā)能夠改善糖代謝的藥物已逐漸成為治療T2DM的研究重點(diǎn)。

鹽地堿蓬(Suaedasalsa(L.) Pall.)為一年生藜科草本植物，清代《本草綱目拾遺》引《脈藥聯(lián)珠藥性考》闡述了鹽地堿蓬的性味功效為“味咸性涼，清熱消積”，《河北省本草圖鑒》闡述了鹽地堿蓬性味歸經(jīng)與功用為“微咸，涼。歸腎經(jīng)。清熱消積。用于食積停滯，發(fā)熱”[2]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)鹽地堿蓬含有維生素類、微量元素類、脂肪酸類、黃酮類化合物類、色素類、多糖類物質(zhì)、輔酶Q10、蛋白質(zhì)等多種化學(xué)成分，具有抗炎、抗氧化、降糖等藥理活性[3-8]，但目前對(duì)其具體藥理作用、分子機(jī)制及其作用的具體通路尚不明確。本文進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，通過構(gòu)建2型糖尿病大鼠模型，以不同劑量鹽地堿蓬水煎劑進(jìn)行干預(yù)，觀察血糖、GHb、C-P等指標(biāo)，胰腺組織病理形態(tài)學(xué)以及胰腺組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved-Caspase-3 蛋白表達(dá)水平的變化，探討鹽地堿蓬改善T2DM大鼠糖代謝的相關(guān)作用機(jī)制，為應(yīng)用鹽地堿蓬治療2型糖尿病提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 供試動(dòng)物

SPF級(jí)4周齡SD雄性大鼠70只，120±5 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0008，合格證號(hào)：1103221911004286。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，批準(zhǔn)編號(hào)LX2019084。

1.2 藥物及試劑

鹽酸二甲雙胍片(格華止，中美上海施貴寶制藥有限公司，批號(hào)AAZ0889)；鹽地堿蓬采摘于河北省唐山市曹妃甸地區(qū)，由田春雨教授鑒定；鏈脲佐菌素(北京博愛港生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20180831)；糖化血紅蛋白(GHb)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)20191008)；C-肽Elisa試劑盒(安迪華泰(中國)生物科技有限公司，批號(hào)AD201910)；β-actin、Bcl-2、Bax一抗(ABclonal，批號(hào)分別為9100026001、0075220402、3560003003)；凝膠試劑盒、Marker(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)。

1.3 儀器

穩(wěn)益血糖儀(三諾生物傳感股份有限公司，儀器編碼：1OH55IH1538)；組織脫水機(jī)(LEICA TP1020)；組織切片機(jī)(LEICA RM2245)；電泳儀(美國BIO-RAD伯樂)；成像系統(tǒng)ChemiDocTM CXRS+ System(美國BIO-RAD伯樂)；M200PR0酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)；正置顯微鏡(日本 OLYMPUS)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模及分組給藥

70只雄性SD大鼠給予維持飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為正常組(10只)和實(shí)驗(yàn)組(60只)，正常組給予維持飼料及純水喂養(yǎng)，模型組給予高脂飼料(購自北京華阜康生物科技股份有限公司)喂養(yǎng)，4周后大鼠禁食12 h腹腔注射STZ緩沖液(30 mg/kg)，正常組給予同劑量的生理鹽水腹腔注射，注射STZ 3天后，所有大鼠測(cè)FBG和PG2h。以16.7 mmol/L>FBG>11.1 mmol/L或PG2h>16.7 mmol/L為成模標(biāo)準(zhǔn)[9]，將成模的老鼠按血糖為模型組11只，二甲雙胍組11只，鹽地堿蓬低、中、高劑量組各11只。分組后給予給藥組不同劑量的藥物灌胃，參考文獻(xiàn)等效劑量換算[10]，二甲雙胍組每天灌胃量為90 mg/kg，鹽地堿蓬組低、中、高組每天灌胃量為405、810、1620 mg/kg(生藥量)[2]，正常組給予相對(duì)應(yīng)的生理鹽水灌注，每周根據(jù)每只大鼠的體重變化調(diào)整灌胃給藥量，共給藥4周。

2.2 檢測(cè)指標(biāo)

2.2.1 常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)

尾靜脈采血檢測(cè)大鼠FBG、PG2h和OGTT，檢測(cè)前12 h大鼠禁食不禁水，以25%葡萄糖按2.5 g/kg劑量灌胃，分別于灌胃前及灌胃后1、2 h尾尖取血測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)血糖[11]；比色法檢測(cè)GHb；酶聯(lián)免疫法(Elisa)檢測(cè)C-P，根據(jù)FBG和C-P結(jié)果計(jì)算IR指數(shù)[12]；HE常規(guī)染色觀察胰腺組織形態(tài)學(xué)變化；參考文獻(xiàn)[13]對(duì)大鼠胰腺進(jìn)行免疫組化中相關(guān)蛋白的檢測(cè)。

2.2.2 胰腺組織Western blot檢測(cè)

每1 mL RIPA裂解液中加入2 μL蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置于冰上備用。蛋白定量后加入上樣緩沖液并煮沸5 min后，通過SDS-PAGE分離樣品并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用TBST洗滌三次后，用BSA封閉2 h，TBST洗滌三次，將膜放置在不同的一抗中4 ℃孵育過夜。第二天用TBST洗滌三次，將膜與二抗在室溫下孵育2 h。然后用TBST洗滌三次，用極超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)蛋白質(zhì)，并使用圖像分析儀通過光密度測(cè)定法定量。

一抗包括針對(duì)Bcl-2、Bax、Caspase-3和cleaved-Caspase-3的兔單克隆抗體。針對(duì)β-actin的兔單克隆抗體和二抗(山羊抗兔)。

2.2.3 數(shù)據(jù)分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 鹽地堿蓬對(duì)T2DM大鼠FBG、PG2h的影響

與正常組相比，模型組及給藥組FBG、PG2h均明顯升高，結(jié)果具有顯著差異(P<0.01)；與模型組相比，鹽地堿蓬組大鼠FBG、PG2h降低，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)(見圖1)。

圖1 鹽地堿蓬對(duì)T2DM大鼠FBG、PG2h的影響Fig.1 Effects of S.salsa on FBG and PG2h in T2DM 注：A為正常組；B為模型組；C為二甲雙胍組；D為鹽地堿蓬低劑量組；E為鹽地堿蓬中劑量組；F為鹽地堿蓬高劑量組(下同)。與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。Note:A is the normal group;B is the model group;C is the metformin group;D is the low dose group of S.salsa;E is the medium dose group of S.salsa;F is the high dose group of S.salsa (the same below).Compared with the normal group,*P<0.05,**P<0.01;Compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01.

3.2 鹽地堿蓬對(duì)T2DM大鼠OGTT-AUC、C-P、IR指數(shù)及GHb的影響

與正常組相比，模型組OGTT-AUC、IR指數(shù)、GHb顯著升高(P<0.01)，C-P顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，鹽地堿蓬組OGTT-AUC、IR指數(shù)、GHb顯著降低(P<0.01)，C-P顯著升高(P<0.05或P<0.01)，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖2)。

圖2 鹽地堿蓬對(duì)T2DM大鼠OGTT-AUC、C-P、IR指數(shù)及GHb的影響Fig.2 Effects of S.salsa on OGTT-AUC、C-P、insulin resistance index and GHb in T2DM 注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。Note:Compared with the normal group,*P<0.05,**P<0.01;Compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01.

3.3 鹽地堿蓬對(duì)大鼠胰腺組織病理形態(tài)的影響

與正常組相比，模型組胰島形態(tài)不規(guī)則，部分胰島細(xì)胞萎縮，細(xì)胞核邊緣化，胞漿出現(xiàn)空泡化，間質(zhì)增生和胰島纖維化明顯；與模型組相比，鹽地堿蓬低劑量組胰島細(xì)胞形態(tài)、胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)量和體積較模型組有所改善；鹽地堿蓬中劑量組胰島形態(tài)、空泡化、間質(zhì)增生、胰島內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量和體積較模型組有所改善；鹽地堿蓬高劑量組胰島形態(tài)與模型組相比較為規(guī)則，無明顯空泡化、間質(zhì)增生和胰島纖維化，且胰島內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量較模型組有所增加(見圖3)。

圖3 鹽地堿蓬對(duì)各組T2DM大鼠胰腺組織病理變化的影響(HE，×40)Fig.3 Effect of S.salsa on pathological changes of pancreas tissue in T2DM rats in each group(HE,×40)

3.5 Bax、Bcl-2蛋白在T2DM大鼠胰腺表達(dá)情況

與正常組相比，模型組胰腺組織中Bax蛋白平均光密度值顯著升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白平均光密度值顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，鹽地堿蓬組胰腺組織中Bax蛋白平均光密度值降低(P<0.05或P<0.01)，Bcl-2蛋白平均光密度值升高(P<0.01)(見圖4～圖6)。

圖4 各組大鼠胰腺組織Bax表達(dá)結(jié)果(免疫組化，×40)Fig.4 Bax expression results in pancreas of rats in each group(IHC,×40)

圖5 各組大鼠胰腺組織Bcl-2表達(dá)結(jié)果(免疫組化，×40)Fig.5 Bcl-2 expression results in pancreas of rats in each group(IHC,×40)

圖6 各組大鼠胰腺組織Bax、Bcl-2蛋白平均光密度值比較Fig.6 Comparison of the average optical density values of Bax and Bcl-2 proteins in pancreatic tissue of rats in each 注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。Note:Compared with the normal group,*P<0.05,**P<0.01;Compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01.

3.5 Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved-Caspase-3蛋白在T2DM大鼠胰腺表達(dá)情況

與正常組相比，模型組胰腺組織中Bax、Caspase-3、cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)；與模型組相比，鹽地堿蓬組胰腺組織中Bax、Caspase-3、cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)(見圖7、8)。

圖7 Western blot檢測(cè)各組大鼠胰腺組織Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)電泳Fig.7 Expression of Bax,Bcl-2,Caspase-3 and cleaved-caspase-3 protein in pancreas of each group detected by Western blot

圖8 鹽地堿蓬對(duì)T2DM大鼠胰腺組織Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Effects of S.salsa on Bax,Bcl-2,Caspase-3 and cleaved-Caspase-3 protein expression in pancreatic tissue of T2DM 注：與正常組比較*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。Note:Compared with the normal group,*P<0.05,**P<0.01;Compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01.

4 討論

目前有關(guān)鹽地堿蓬降糖方面的研究報(bào)道較少，主要以體外實(shí)驗(yàn)為主，其作用機(jī)理尚未明確。本實(shí)驗(yàn)研究構(gòu)建了T2DM大鼠模型，從凋亡途徑觀察鹽地堿蓬對(duì)其胰腺組織的作用，結(jié)果從FBG、PG2h、OGTT、GHb、C-P、IR指數(shù)可以看出，相較于正常組，模型組、二甲雙胍組和鹽地堿蓬低、中、高劑量組大鼠FBG、PG2h、OGTT、GHb、IR指數(shù)均明顯升高，C-P指數(shù)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，這表明T2DM大鼠模型構(gòu)建成功。采用鹽地堿蓬治療后，與模型組相比，大鼠FBG、PG2h、OGTT、GHb、IR指數(shù)均明顯降低，C-P指數(shù)明顯升高(P<0.01)，表明鹽地堿蓬對(duì)糖代謝具有調(diào)節(jié)作用。從正常組、模型組與鹽地堿蓬組的比較結(jié)果可以看出，隨著給藥時(shí)間的延長，大鼠各項(xiàng)指標(biāo)均有所改善，說明鹽地堿蓬改善糖代謝效果有一定的時(shí)效關(guān)系。

T2DM是一種內(nèi)分泌代謝性疾病，研究表明，胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能障礙是2型糖尿病發(fā)病的兩大機(jī)制，特別是胰島β細(xì)胞功能減弱或喪失，是導(dǎo)致胰島素分泌相對(duì)不足或絕對(duì)不足的根本機(jī)制,因此保護(hù)胰島組織是治療糖尿病的有效途徑之一[14]。正常的胰島結(jié)構(gòu)是維持胰島正常生理學(xué)功能的基礎(chǔ),在糖尿病的不同發(fā)展階段，胰島組織形態(tài)會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的改變，這種改變是胰島功能障礙的基礎(chǔ)[15]。HE染色顯示模型組胰島形態(tài)不規(guī)則，部分胰島細(xì)胞萎縮，細(xì)胞核邊緣化，胞漿出現(xiàn)空泡化，間質(zhì)增生和胰島纖維化明顯；與模型組相比，鹽地堿蓬可以改善胰島的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，從而改善胰島功能障礙，促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素。

Bcl-2蛋白家族在細(xì)胞凋亡的過程中起關(guān)鍵作用并激活Caspase家族蛋白，Bcl-2蛋白家族包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，Bax(促凋亡蛋白)的表達(dá)增加與Bcl-2(抗凋亡蛋白)的同時(shí)減少以及Bax/Bcl-2比率的升高是細(xì)胞凋亡的原因之一[16]，細(xì)胞應(yīng)激物改變了Bcl-2蛋白家族的促凋亡成員和抗凋亡成員之間相互作用的細(xì)胞內(nèi)平衡，開放線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道(mPTP)，釋放CytC進(jìn)入胞質(zhì)與凋亡誘導(dǎo)因子結(jié)合，進(jìn)而形成CytC-Apaf-1-Procaspase-9“凋亡體”[17]，繼之Caspase-9酶切Caspase-3酶原，啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡[18]，其中Caspase-3是最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白。本實(shí)驗(yàn)研究通過免疫組化和Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在模型組中Bax、Caspase-3、cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)；與模型組相比，鹽地堿蓬組Bax、Caspase-3、cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)下調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)。表明鹽地堿蓬可以調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved-Caspase-3蛋白的表達(dá)。

綜上所述，鹽地堿蓬可以降低T2DM大鼠FBG、PG2h、OGTT-AUC、IR指數(shù)以及GHb，升高T2DM大鼠C-P，能夠有效改善T2DM大鼠糖代謝，其作用機(jī)制可能與上調(diào)Bcl-2，下調(diào)Bax、Caspase-3、cleaved-Caspase-3的蛋白表達(dá)有關(guān)。