戴研平 高曉勤 倪佳

1.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.遵義醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義563006；3.岳陽(yáng)市岳陽(yáng)樓區(qū)人民醫(yī)院，湖南 岳陽(yáng) 414000；4.洛陽(yáng)市人民醫(yī)院，河南 洛陽(yáng) 471000

蛋白激酶A（PKA）是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子，在各種組織中高表達(dá)，PKA 是被發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)蛋白激酶［1］，PKA 還參與調(diào)節(jié)精子的獲能和頂體反應(yīng)，與男性不育密切相關(guān)［2］。精子頂體內(nèi)透明質(zhì)酸酶（HYD）在受精過(guò)程中的精卵識(shí)別、結(jié)合階段所起到至關(guān)重要的作用［3］。本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)精子透明質(zhì)酸酶活性強(qiáng)度及陽(yáng)性反應(yīng)率與精液參數(shù)存在顯著相關(guān)性［4］。大量研究表明，頂體是特殊的溶酶體，內(nèi)含有頂體酶、透明質(zhì)酸酶等，均參與受精過(guò)程。目前蛋白激酶與男性不育的關(guān)系越來(lái)越引起人們的重視。但有關(guān)蛋白激酶A 與透明質(zhì)酸酶相關(guān)性的報(bào)道較少見(jiàn)。本研究測(cè)定人精液PKA 含量對(duì)精子HYD 陽(yáng)性率的影響，為男性不育的診斷和治療提供實(shí)驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2016～2017 年貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心門(mén)診健康中青年男性自愿獻(xiàn)精者17 例（已正常生育1 個(gè)或2 個(gè)子女）作為正常生育組，年齡20～40 歲。選擇同期生殖中心門(mén)診的不育患者36例作為不育組，年齡20～40 歲。依據(jù)WHO 推薦的不育診斷標(biāo)準(zhǔn)，即女方婦產(chǎn)科檢查正常，婚后1 年正常性生活不育、精液常規(guī)檢查中精子的數(shù)量少于20×106/mL男性不育患者，無(wú)家族遺傳病史，無(wú)外傷，無(wú)嚴(yán)重軀體性疾病；排除隱睪癥、腮腺炎、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病等［5］。根據(jù)精液常規(guī)檢查分析結(jié)果，將不育組劃分為三組：不明原因不育組（9 例）、少精或畸形精子多組（15 例）、泌尿生殖系統(tǒng)炎癥組（12 例）。

1.2 儀器與試劑 偉力WLJY9000 彩色精子質(zhì)量檢測(cè)系統(tǒng)（北京中科恒業(yè)有限公司）；9905014 型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（上海 Leica 儀器有限公司）；Sartorius BS2103 電子天平（德國(guó)Sartorius 公司）；高速冷凍離心機(jī)（sigma公司）；PX-150C 型恒溫恒濕箱（天津?qū)嶒?yàn)儀器廠(chǎng)）；酶標(biāo)儀（伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）；PKA 檢測(cè)試劑盒（南京生物建成有限公司），改良透明質(zhì)酸鈉—明膠底物膜（自制）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本收集。所有研究對(duì)象均禁欲3～7 天，用新潔爾滅消毒手及尿道口，以手淫法獲取1 次全部精液，置入37℃恒溫恒濕箱中30min 待其液化，采用偉力彩色精子質(zhì)量檢測(cè)系統(tǒng)做精液常規(guī)分析，并獲得精子活力值。

1.3.2 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試（定量）人精液PKA 含量。精液PKA 含量的測(cè)定，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.3 改良透明質(zhì)酸鈉—明膠底物膜法測(cè)HYD 陽(yáng)性率。選用本課題組改良透明質(zhì)酸鈉—明膠底物膜法制作底物膜，采集的新鮮精液室溫30min 液化后，2400r/min 離心 10min，共 2 次，以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗，5min，共2 次。沉淀物懸浮于2 倍以上磷酸鹽緩沖液（PBS）中，分雙份備用。將上述PBS 精子懸浮液1、2滴涂于藥盒底膜片，37℃恒溫恒濕箱孵育，3h 后取出，室溫下干燥，于普通光鏡下觀(guān)察孵育結(jié)果并染色。

1.4 觀(guān)察指標(biāo) 終止孵育后，每組隨機(jī)觀(guān)察5 張切片，每張切片選擇5 個(gè)視野，以精子頭部周?chē)霈F(xiàn)暈環(huán)者為陽(yáng)性，并用微尺測(cè)量視野下每個(gè)精子頭部暈環(huán)直徑的大小，取其平均值作為判斷HYD 活性強(qiáng)度的指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用 t 檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，兩兩比較用LSD 檢驗(yàn)，采用相關(guān)分析分析相關(guān)性。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HYD 陽(yáng)性率 光鏡下檢測(cè)，正常生育組HYD 反應(yīng)平均陽(yáng)性率為80.74%，最高陽(yáng)性率達(dá)92.45%；不明原因不育組的HYD 反應(yīng)平均陽(yáng)性率為50.32%，最高達(dá)90.86%；少精或精子畸形數(shù)多組的HYD 反應(yīng)平均陽(yáng)性率為24.64%，最高達(dá)49.62%；曾患過(guò)泌尿生殖系統(tǒng)炎癥組的HYD 反應(yīng)平均陽(yáng)性率為33.04%，最高達(dá)84.78%。見(jiàn)圖1。

圖1 各組HYD 陽(yáng)性率檢測(cè)結(jié)果（LM 10×40）

2.2 各組中PKA 含量與HYD 陽(yáng)性率 與正常生育組比較，不明原因不育組、少精或畸形精子多組、泌尿生殖系統(tǒng)炎癥組精子PKA 含量與HYD 陽(yáng)性率均下降（P＜0.05）。與不明原因不育組比較，少精或畸形精子多組、泌尿生殖系統(tǒng)炎癥組精子PKA 含量與HYD 陽(yáng)性率下降（P＜0.05）。其余各組間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表 1。

2.3 精子PKA 含量與HYD 陽(yáng)性率的相關(guān)性分析 生育組及不育各組中精子PKA 含量與HYD 陽(yáng)性率的相關(guān)圖（散點(diǎn)圖）如下。精子PKA 含量與HYD 陽(yáng)性率呈顯著正相關(guān)（r=0.873，P＜0.01）。見(jiàn)圖 2。

表 1 各組中 PKA 含量與 HYD 陽(yáng)性率（）

表 1 各組中 PKA 含量與 HYD 陽(yáng)性率（）

注：與正常生育組比較：aP＜0.01，與不明原因組比較：bP＜0.05

組別 n PKA 含量（ng/mL） HYD 陽(yáng)性率（%）正常生育組 17 664.76±83.63 80.74±18.3不明原因不育組 9 511.33±56.93a 50.32±13.1a少精或畸形精子多組 15 459.27±30.74ab 24.64±10.1ab泌尿生殖系統(tǒng)炎癥組 12 472.17±25.37ab 33.04±11.6ab

3 討論

圖2 精子PKA 含量與HYD 陽(yáng)性率的相關(guān)圖（散點(diǎn)圖）

生殖細(xì)胞內(nèi)酶學(xué)檢查是判斷男性生育力強(qiáng)弱的一個(gè)重要指標(biāo)。透明質(zhì)酸酶是一種以降解透明質(zhì)酸為主的糖苷酶，關(guān)于透明質(zhì)酸酶及其相關(guān)的研究越來(lái)越引起人們的重視［6］。吳軍等［7］發(fā)現(xiàn)精液透明質(zhì)酸酶活性降低和磷脂酶A2 含量缺乏可能是引起男性不育的病因之一。本課題組前期研究結(jié)果表明，精液中NO 含量、精子頂體內(nèi)透明質(zhì)酸酶、精漿中α-1，4 糖苷酶、人精子內(nèi)頂體蛋白酶、雙羰基/L－木酮糖還原酶（DCXR）均可能是引起男性不育的重要因素［8-12］。本課題組前期研究還發(fā)現(xiàn)精液沙眼衣原體（CT）感染能夠使精液中NO 含量升高和精子頂體內(nèi)HYD 活性下降，影響男性生育力［13］。

本研究結(jié)果顯示，與正常生育組比較，不育各組中的精子PKA 含量和精子HYD 陽(yáng)性率均較低。與不明原因組比較，少精或畸形精子多組精子PKA 含量均較低。不育組中的PKA 含量的減少是導(dǎo)致精子HYD 陽(yáng)性率減弱可能是導(dǎo)致男性不育的重要原因之一。本實(shí)驗(yàn)表明了精子PKA 含量與精子HYD 陽(yáng)性率呈顯著正相關(guān)，也間接說(shuō)明PKA 的含量與頂體反應(yīng)有相關(guān)性，而頂體是精子頭部的重要組成部分，頂體發(fā)生異常最終會(huì)導(dǎo)致男性的生育能力下降［14］。

總之，受精是一個(gè)復(fù)雜和多因素參與的過(guò)程，精液中PKA 含量可能通過(guò)影響精子活力、頂體酶活性和HYD 陽(yáng)性率，從而影響受精能力，進(jìn)而導(dǎo)致男性不育，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。