邰小鳳

天水市第一人民醫(yī)院，甘肅 天水 741000

乙肝肝硬化為一種慢性進(jìn)行性肝病，由乙肝長期反復(fù)作用形成的臨床疾病。乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）是一種嗜肝性DNA 病毒，可通過接觸被感染者的體液、血液進(jìn)行傳播，從而引起乙肝肝硬化。該病在發(fā)病早期無明顯的臨床癥狀，20%左右的患者可進(jìn)展為肝衰竭、肝癌等，嚴(yán)重情況下可導(dǎo)致患者死亡［1］。乙肝肝硬化在病理上可表現(xiàn)為纖維結(jié)締組織增生、肝細(xì)胞損傷、肝細(xì)胞再生、肝變形壞死等，其發(fā)病除了與HBV 有關(guān)外，也與遺傳、自身抗原、免疫紊亂等多種因素相關(guān)［2］。研究發(fā)現(xiàn)乙肝肝硬化患者的肝組織和外周血中存在大量的自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞，從而促進(jìn)該病的炎癥反應(yīng)過程［3］。Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）是近年來發(fā)現(xiàn)的在獲得性免疫系統(tǒng)、天然免疫中都發(fā)揮重要作用的模式識別受體家族，也是能夠識別病原微生物表達(dá)的保守結(jié)構(gòu)基因序列。TLRs 可以啟動細(xì)胞因子的釋放，激發(fā)機(jī)體對病原體的免疫反應(yīng)，特別是TLR2 可以識別多種病原微生物，包括支原體、螺旋體、革蘭氏陽性菌等，從而導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生不同的抗細(xì)菌、抗病毒免疫反應(yīng)［4］。本文探討了乙肝肝硬化患者HBV-DNA 水平與TLR2 表達(dá)的相關(guān)性，希望為乙肝肝硬化發(fā)病機(jī)制的研究提供思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018 年2 月到2020 年3 月天水市第一人民醫(yī)院診治的乙肝患者320 例作為研究對象，根據(jù)肝硬化情況分為觀察組（合并肝硬化，n=120）與對照組（無合并肝硬化，n=200），兩組患者的病程、體重指數(shù)、性別、年齡、Child-Pugh 分級、收縮壓、舒張壓等對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)實施，患者簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合慢性乙肝的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］；HBV-DNA 檢測陽性；年齡 20～80 歲；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：近3 個月使用過免疫抑制劑的患者、妊娠與哺乳期婦女、合并艾滋病、腫瘤等患者、自身免疫性肝病、遺傳代謝因素引起的肝病。

1.3 HBV-DNA 檢測 采集患者空腹靜脈血，3000r/min離心6min，取上層血清液，采用實時免疫熒光PCR 檢測血清HBV-DNA 含量（以Log 數(shù)計量）。同時采用全自動生化分析儀測定血清總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALP）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBIL）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（glutamyl transpeptidase，GGT）。

1.4 TLR2 檢測 取空腹靜脈血，1500rpm 室溫離心10min，吸取上清至距離紅細(xì)胞層約1～2cm 區(qū)域白層，分裝至凍存管中。采用密度梯度離心法分離單個核細(xì)胞，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測單核細(xì)胞表面TLR2 表達(dá)水平，以平均免疫熒光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity，MFI）表示 TLR2 表達(dá)強(qiáng)度。

1.5 觀察指標(biāo) （1）對比兩組的HBV-DNA 表達(dá)水平；（2）對比兩組的 TLR2 表達(dá)水平；（3）分析乙肝肝硬化患者HBV-DNA 水平與TLR2 表達(dá)的相關(guān)性；（4）分析乙肝肝硬化患者TLR2 表達(dá)的影響因素。

1.6 統(tǒng)計方法 采用SPSS 21.0 軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（呈正態(tài)分布，對比方法為t 檢驗），計數(shù)數(shù)據(jù)用率表示（對比方法為卡方檢驗），相關(guān)性分析采用多重線性回歸分析與Pearson 相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

2.1 對比兩組HBV-DNA 表達(dá)水平 觀察組的血清HBV-DNA 含量高于對照組，血清 TBiL、DBiL、ALP、GGT值明顯高于對照組（P＜0.05）。見表2。

2.2 TLR2 表達(dá)水平對比 觀察組 TLR2 水平為（178.29±22.18），對照組為（79.92±12.77），觀察組單個核細(xì)胞的TLR2 表達(dá)水平顯著高于對照組（t=44.371，P＜0.001）。

表1 兩組一般資料對比

表2 兩組HBV-DNA 表達(dá)水平（）

表2 兩組HBV-DNA 表達(dá)水平（）

組別nHBV-DNA（Log）TBi（μmol/L）DBi（μmol/L）ALP（U/L）GGT（U/L）觀察組 120 6.56±0.89 35.54±3.43 24.31±3.52 750.21±10.34 482.33±12.46對照組 200 5.61±0.98 27.42±2.89 18.66±3.44 560.41±14.24 296.54±13.62 t 8.685 22.662 14.085 127.231 121.93 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 相關(guān)性分析 Pearson 分析顯示，HBV-DNA、TBiL、DBiL、ALP、GGT 水平與 TLR2 表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）。以 HBV-DNA、TBiL、DBiL、ALP、GGT 水平作為自變量，以TLR2 表達(dá)作為因變量，多重線性回歸分析顯示 HBV-DNA、TBiL、DBiL、ALP、GGT 水平為影響 TLR2表達(dá)的主要影響因素（P＜0.05）。見表3、表4。

表3 乙肝肝硬化患者HBV-DNA 水平與TLR2 表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

HBV 是一種嗜肝DNA 病毒，不同人群感染HBVDNA 后可呈現(xiàn)不同的預(yù)后。80%人群感染后體內(nèi)的病毒很快被清除，而20%人群則不能有效清除感染病毒而發(fā)展成慢性感染，其中有20%左右發(fā)展成肝硬化。乙肝肝硬化是乙肝發(fā)展的后期階段，以再生結(jié)節(jié)形成、彌漫性肝纖維化、假小葉為特征，導(dǎo)致肝臟儲備功能嚴(yán)重受損，嚴(yán)重情況下可進(jìn)展為肝衰竭與肝癌［6］。本研究顯示，觀察組的血清HBV-DNA 含量高于對照組，血清 TBiL、DBiL、ALP、GGT 值明顯高于對照組，表明乙肝肝硬化患者除了肝功能嚴(yán)重受損外，也伴隨有HBVDNA 的高表達(dá)。從機(jī)制上分析，HBV-DNA 的大量復(fù)制易造成肝纖維結(jié)締組織增生，肝細(xì)胞再生結(jié)節(jié)變多，細(xì)胞外基質(zhì)沉積，伴隨有肝小葉結(jié)構(gòu)受損，從而可進(jìn)展為肝纖維化與肝硬化，同時TBiL、DBiL、ALP、GGT上升，表明患者肝臟儲備功能下降，肝細(xì)胞受損嚴(yán)重，也容易發(fā)生肝硬化。

表4 影響乙肝肝硬化患者TLR2 表達(dá)的影響因素

乙肝患者體內(nèi)HBV 不斷復(fù)制，通過機(jī)體的免疫機(jī)制，造成纖維結(jié)締組織增生與肝細(xì)胞再生，最終進(jìn)展為肝硬化。TLR2 是與病毒感染關(guān)系較為密切的一種模式識別受體，TLR2 激活可以導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生不同的免疫反應(yīng)機(jī)制，其在結(jié)構(gòu)上分為胞外段、跨膜段和胞內(nèi)段，特別是胞外段富含亮氨酸重復(fù)序列的N 端，可識別病原體細(xì)胞表面的分子標(biāo)志。胞內(nèi)區(qū)負(fù)責(zé)TLR2 下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可調(diào)節(jié)獲得性免疫、固有免疫作用。有研究顯示，HBV-DNA 可與人巨噬細(xì)胞的硫酸乙酰肝素成分結(jié)合后，從而激活TLR2 信號通路；另外機(jī)體的內(nèi)源性配體等也可激活TLR2，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的分泌，從而引起肝損傷［7］。本研究顯示觀察組單個核細(xì)胞的TLR2表達(dá)水平顯著高于對照組。表明HBV-DNA 大量復(fù)制可上調(diào)TLR2 的功能性表達(dá)，從而增加相關(guān)炎癥和細(xì)胞因子的表達(dá)，改變機(jī)體免疫反應(yīng)，從而誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生肝硬化。

本研究Pearson 分析顯示乙肝肝硬化患者的HBV-DNA、TBiL、DBiL、ALP、GGT 水平與 TLR2 表達(dá)呈正相關(guān)，主要是由于乙肝患者血清HBV-DNA 水平反映了病毒在肝臟內(nèi)的復(fù)制程度，其復(fù)制過程中引發(fā)了機(jī)體免疫病理反應(yīng)，也會激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)對乙肝病毒的清除，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷、破壞與肝臟組織纖維化，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)肝臟炎癥及損傷修復(fù)反應(yīng)，也會誘發(fā)TLR2 的大量表達(dá)。

多重線性回歸分析顯示，HBV-DNA、TBiL、DBiL、ALP、GGT 水平為影響TLR2 表達(dá)的主要影響因素，表明乙肝肝硬化患者HBV-DNA 水平與TLR2 表達(dá)存在顯著相關(guān)性。從機(jī)制上分析，HBV-DNA 大量復(fù)制可促進(jìn)TLR2 激活，影響抗原呈遞細(xì)胞功能，幫助病毒逃逸機(jī)體的免疫監(jiān)視，激活炎癥因子的表達(dá)，導(dǎo)致免疫紊亂，造成肝細(xì)胞損傷的發(fā)生。并且TLR2 過量表達(dá)可激活肝星狀細(xì)胞和庫普弗細(xì)胞表達(dá)，啟動半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活，刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)化生長因子β，可導(dǎo)致肝細(xì)胞的凋亡或死亡。也有研究表明，表達(dá)TLR2 的細(xì)胞如果發(fā)生凋亡，可降低過度的免疫應(yīng)答，可保障調(diào)控免疫應(yīng)答在適度的水平，從而有利于改善乙肝患者的預(yù)后［8］。本研究也存在一定的不足，TLR 存在多個亞型分子，沒有對TLR4、TLR6 等進(jìn)行分析，且沒有進(jìn)行遠(yuǎn)期隨訪，將在后續(xù)研究中深入探討。

總之，乙肝肝硬化患者伴隨有HBV-DNA 的大量復(fù)制與TLR2 的高表達(dá)，兩者存在正相關(guān)性，檢測HBVDNA、TLR2 表達(dá)水平對指導(dǎo)乙肝肝硬化患者診療有重要臨床價值。