張燕 姚露 江龍委 伍小勇

1.東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，江蘇 南京 210002；2.無(wú)錫聯(lián)勤保障中心藥品儀器監(jiān)督檢驗(yàn)站，江蘇 南京 210002

抑郁癥是一種常見精神疾病。臨床上以明顯而持久的心境低落為主要表現(xiàn)，并伴有運(yùn)動(dòng)遲滯。隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏加快，社會(huì)壓力增大，其發(fā)病率逐年上升，在發(fā)達(dá)國(guó)家其患病率已躍居第一位［1］。目前認(rèn)為抑郁癥是單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其受體、HPA 軸功能失調(diào)、免疫因素等多因素綜合作用結(jié)果［2-3］。

抑郁癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，難以開展針對(duì)性地治療。臨床治療主要有以下途徑：（1）藥物治療。目前一線用藥主要是選擇性5-HT 再攝取抑制劑（如氟西汀）［4］。（2）社會(huì)心理治療，主要改變患者不適當(dāng)?shù)恼J(rèn)知或思考習(xí)慣［5］。（3）電休克療法（ECT），以一定量的電流通過(guò)大腦，引起意識(shí)喪失和痙攣發(fā)作，可迅速緩解病情［6］。（4）中醫(yī)藥治療［7］。

近年來(lái)影像學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，海馬體損傷是多數(shù)抑郁癥患者的共同表現(xiàn)［8］。海馬是邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，而邊緣系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)內(nèi)臟功能活動(dòng)和情緒反應(yīng)的雙重功能，因此能否通過(guò)修復(fù)海馬神經(jīng)元來(lái)治療抑郁成為研究熱點(diǎn)。海馬主要由海馬回和齒狀回組成，齒狀回內(nèi)存在神經(jīng)干細(xì)胞且可終身產(chǎn)生新的神經(jīng)元。神經(jīng)干細(xì)胞通常具備四個(gè)特性：自我更新、增殖分裂、多潛能性、應(yīng)激能力。神經(jīng)干細(xì)胞受到刺激經(jīng)不對(duì)稱分裂成為神經(jīng)干細(xì)胞和祖細(xì)胞，祖細(xì)胞最終分化成為神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，整合到齒狀回的顆粒細(xì)胞層，從而具備突觸傳遞功能。在大鼠慢性不可預(yù)見性應(yīng)激（CUMS）抑郁癥模型研究中發(fā)現(xiàn)，海馬錐體細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，數(shù)量減少，排列疏松不齊，齒狀回苔蘚纖維末梢突觸小泡聚集在激活的突觸帶附近，存在耗損現(xiàn)象［9］。

基于已有的報(bào)道，本研究小組建立CUMS 大鼠抑郁癥模型，體外回輸神經(jīng)干細(xì)胞，研究神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)大鼠抑郁癥的干預(yù)作用，尋找更有效的抗抑郁途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用清潔級(jí)Wistar 大鼠（雄性）50 只，體重（200±20）g，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，動(dòng)物合格證號(hào)（201401142）。

1.2 主要試劑及儀器 試劑：氟西?。ㄌK州禮來(lái)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：J20030017）；蔗糖（上海源葉生物科技公司，S11055）；Anti-Nestin antibody（Abcam，ab6142），HiScriPtⅡQ RT SuPerMix for qPCR（Vazyme，R222-01），蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（Beyotime，C0105），DMEM/F12（Gibco，11330032）。儀器：分光光度計(jì)（日本SHIMAZDUUV-2540）；高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)eppendorf，5024R）；臺(tái)式恒溫振蕩器（中國(guó)上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，THZ-312）；脫色搖床（中國(guó)江蘇金壇市正基儀器廠，HY-4）；分析天平（德國(guó) Sartorius，BL310/BL21S）；組織勻漿器（中國(guó)海門愛苯德，2mL）；渦旋振蕩器（中國(guó)海門其林貝爾，XW-80A）；移液器（德國(guó)eppendorf，2.5/10/200/1000μL）；熒光定量 PCR 儀（ABI 7500）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CUMS 大鼠抑郁癥模型的建立。采用Willner等［10］提出的抑郁動(dòng)物模型的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行建立。Wistar大鼠共50 只，其中10 只大鼠合籠飼養(yǎng)為空白組，其余40 只大鼠采取孤養(yǎng)進(jìn)行造模。造模組按照以下應(yīng)激方式在28d 內(nèi)：禁食不禁水24h；禁水不禁食24h；4℃游泳5min；夾尾1min（止血鉗距尾根1cm）；束縛應(yīng)激 2h；40℃環(huán)境 5min；潮濕墊料、鼠籠傾斜（45°）24h；懸吊5min；明暗顛倒24h。每日采用1 種刺激，每種刺激平均被采用2 次，每種刺激不能連續(xù)出現(xiàn)。分別在0、7、14、21、28 天記錄每只大鼠體重。

1.3.2 行為學(xué)測(cè)定。①分別在 0、7、14、21、28 天給予所有大鼠1 瓶純水和1 瓶2%蔗糖水，均為50g，大鼠自由飲用60min 后移走兩瓶水并分別稱重。記錄每只動(dòng)物的總液體消耗、糖水消耗、純水消耗。計(jì)算糖水偏好（糖水偏好=糖水消耗/總液體消耗×100%）。②曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（Open-field）設(shè)備為 80cm×80cm×40cm 光潔敞箱，底面平均劃分為25 個(gè)等邊方格，內(nèi)面用黑漆涂滿，置于安靜的房間內(nèi)。分別在 0、7、14、21、28 天將大鼠置于中心方格內(nèi)，觀察大鼠行為學(xué)，如5min 內(nèi)穿越格數(shù)、后肢直立次數(shù)。穿越1 格計(jì)為1 分，后肢直立1 次計(jì)為1 分。

1.3.3 神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)。①懷孕11.5~13d 雌大鼠引頸處死，打開腹腔取出胎鼠，分離海馬組織并剪碎，透明質(zhì)酸酶、膠原酶消化，原代接種。②神經(jīng)干細(xì)胞的傳代：當(dāng)神經(jīng)干細(xì)胞長(zhǎng)至80%后，按照1∶4 進(jìn)行傳代。

1.3.4 神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定。①收集神經(jīng)干細(xì)胞；②接種于0.1%明膠包被；③4%多聚甲醛固定；④PBS 清洗3次；⑤封1h 5%FBS 液；⑥一抗4℃孵育過(guò)夜；⑦FITC標(biāo)記的二抗室溫避光孵育4h；⑧光顯微鏡觀察。

1.4 大鼠給藥方法 21 天將造模組大鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，分別為模型組，氟西汀組，神經(jīng)干細(xì)胞組，陰性對(duì)照組，每組10 只。模型組：22 天給予氟西汀組等體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)7 天；氟西汀組：22 天給予氟西汀灌胃 2mg/kg，連續(xù) 7 天；神經(jīng)干細(xì)胞組：22 天，接受腦室內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞移植（10μL 細(xì)胞懸液：1.0×105細(xì)胞懸浮于 10μL 生理鹽水）；陰性對(duì)照組：22 天，接受腦室內(nèi)注射10μL 生理鹽水。

1.5 海馬組織HE 染色及神經(jīng)相關(guān)因子表達(dá)測(cè)定 29天，處死大鼠，取海馬組織。HE 染色觀察海馬細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。RT-PCR 檢測(cè)海馬組織腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶-42（ERK-42）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶-44（ERK-44）神經(jīng)因子表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以表示，采用 t 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)干細(xì)胞鑒定 神經(jīng)干細(xì)胞在顯微鏡下呈球形懸浮生長(zhǎng)，經(jīng)鑒定nestin 蛋白表達(dá)陽(yáng)性（見圖1），且在一定的條件下能分化成神經(jīng)元細(xì)胞、星形角質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，符合神經(jīng)干細(xì)胞的特征。

2.2 造模前后及治療后大鼠的體重變化 造模21 天，與空白組比較，造模組體重明顯下降（P＜0.05）。28 天氟西汀組和神經(jīng)干細(xì)胞組經(jīng)治療7 天后，兩組大鼠體重相較于模型組均顯著性升高（P＜0.05）。見圖2。

2.3 造模前后及治療后大鼠的糖水偏好變化 造模21 天，造模組大鼠糖水偏好度明顯低于空白組（P＜0.01）。28 天，氟西汀組與神經(jīng)干細(xì)胞組糖水偏好度相較于模型組均顯著性升高（P＜0.05）。見圖3。

2.4 造模前后及治療后大鼠的垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)變化 造模21 天，造模各組垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)較空白組顯著性降低（P＜0.01）。28 天，神經(jīng)干細(xì)胞組大鼠垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)相較于模型組顯著性升高（P＜0.05），且改善情況明顯高于氟西汀組（P＜0.01）。見圖 4。

圖1 神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài)

圖2 造模前后及治療后大鼠的體重變化

圖4 造模前后及治療后大鼠的垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)變化

圖3 造模前后及治療后大鼠的糖水偏愛度變化

圖5 造模前后及治療后大鼠的水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)變化

2.5 造模前后及治療后大鼠的水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)變化 造模21 天，造模各組水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)均明顯低于空白組（P＜0.05）。28 天，神經(jīng)干細(xì)胞組和氟西汀組水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)均明顯高于模型組（P＜0.01），且神經(jīng)干細(xì)胞組改善情況明顯高于氟西汀組（P＜0.05）。見圖5。

2.6 治療后各組海馬組織HE 染色情況 模型組海馬區(qū)HE 染色圖，表現(xiàn)為錐體細(xì)胞排列紊亂、層次不清。多數(shù)錐體細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核固縮。白質(zhì)血管周圍間隙增大，呈輕度血管性水腫。部分血管周圍有紅細(xì)胞，疑為漏出性出血。神經(jīng)干細(xì)胞組HE 染色圖，錐體細(xì)胞排列整齊，層次清楚，錐體細(xì)胞核大而圓，核仁明顯、數(shù)目多。細(xì)胞無(wú)變性、壞死，無(wú)增生。白質(zhì)無(wú)水腫。氟西汀組也有一定海馬修復(fù)作用，但不如神經(jīng)干細(xì)胞組。見圖6。

圖6 治療后各組海馬組織HE 染色情況

2.7 治療后各組神經(jīng)相關(guān)因子的表達(dá) 造模后，模型組 BDNF、CREB、ERK-42、ERK-44 因子表達(dá)均顯著低于空白組（P＜0.01），陰性對(duì)照組及氟西汀組經(jīng)治療后無(wú)明顯改善（P＞0.05）。相較于模型組，神經(jīng)干細(xì)胞組BDNF、CREB、ERK-42、ERK-44 的表達(dá)均明顯升高（P＜0.05）。見圖 7。

圖7 治療后神經(jīng)相關(guān)因子的變化

3 討論

抑郁癥和其他神經(jīng)性疾病比如癲癇、中風(fēng)等一樣都是由神經(jīng)系統(tǒng)受損或其功能紊亂引起的。大多數(shù)抑郁癥產(chǎn)生的原因，是神經(jīng)遞質(zhì)的不平衡—也就是在大腦中傳遞信號(hào)的細(xì)胞發(fā)生了功能紊亂而無(wú)法準(zhǔn)確傳遞信號(hào)物質(zhì)。

抑郁癥形成過(guò)程中存在神經(jīng)元萎縮、再生受損以及凋亡的可塑性變化。有研究表明，CUMS 致大鼠抑郁行為可能與神經(jīng)元氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡，自由基生成增加，由此致海馬神經(jīng)元受損和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）表達(dá)減少有關(guān)，而這些損傷與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)［11-12］。環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）是廣泛存在于神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子，具有激活BDNF 作用。研究證實(shí)海馬和額葉部位CREB 磷酸化水平可能與應(yīng)激導(dǎo)致的情緒精神障礙發(fā)生機(jī)制相關(guān)［13］。研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2信號(hào)通路對(duì)調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和存活起關(guān)鍵作用。當(dāng)受到應(yīng)激、炎癥、生長(zhǎng)因子等細(xì)胞外信號(hào)刺激后信號(hào)通路被激活，轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子CREB 的活性，參與細(xì)胞增殖與分化。慢性應(yīng)激刺激導(dǎo)致抑郁模型大鼠海馬區(qū)ERK 蛋白表達(dá)下降，進(jìn)一步證實(shí)ERK 與抑郁癥的發(fā)病密切相關(guān)［14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，大鼠CUMS 抑郁癥模型海馬區(qū)的BDNF、CREB、ERK-42、ERK-44 表達(dá)量均明顯低于空白組（P＜0.01）。在海馬區(qū)給予神經(jīng)干細(xì)胞治療后，大鼠海馬區(qū)的BDNF、CREB、ERK-42、ERK-44 表達(dá)量較模型組顯著升高（P＜0.05），說(shuō)明神經(jīng)干細(xì)胞可提高神經(jīng)相關(guān)因子表達(dá)，從而修復(fù)受損的海馬神經(jīng)元，達(dá)到治療抑郁癥的目的。

海馬損傷是抑郁癥中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要病理表現(xiàn)，它與以下途徑亢進(jìn)有關(guān)，即下丘腦-腺垂體-腎上腺軸-谷氨酸-N-甲基-D-天冬氨酸受體-一氧化氮，并且該途徑能夠抑制海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化，導(dǎo)致海馬自身修復(fù)能力降低，進(jìn)而引起海馬萎縮［15］。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道成人腦細(xì)胞中神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cell，NSCs）的增殖可以產(chǎn)生功能性的神經(jīng)元，也就是說(shuō)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷可以通過(guò)大腦中內(nèi)源性NSCs 的治療得到改善［16］。以上研究結(jié)果表明，抑郁癥的發(fā)生與海馬神經(jīng)元受損有關(guān)，促進(jìn)海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化對(duì)抑郁癥的治療至關(guān)重要。本研究HE 染色結(jié)果提示，大鼠腦部局部注射NSCs 可改善海馬損傷，從而減輕神經(jīng)系統(tǒng)損傷。

神經(jīng)干細(xì)胞具有高度的自我更新能力、低免疫原性、多潛能分化、遷移功能及良好的組織融合性等特性［17-18］。雖然這類細(xì)胞終身存在，但限于絕對(duì)數(shù)量和局部微環(huán)境，損傷神經(jīng)組織自我修復(fù)作用微乎其微。現(xiàn)有的研究證實(shí)，外源性的NSCs 移植是治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病最具前景的治療方法之一。于立堅(jiān)等人［19］通過(guò)對(duì)小鼠腦損傷模型進(jìn)行了研究，探討神經(jīng)干細(xì)胞裂解液的無(wú)細(xì)胞濾液（cell-free filtrate of neural stem cell lysates，F(xiàn)NSCL）腦室內(nèi)注射促進(jìn)谷氨酸鹽誘導(dǎo)的成年小鼠興奮性神經(jīng)元損傷修復(fù)的可能性。結(jié)果顯示，無(wú)論是神經(jīng)干細(xì)胞裂解液無(wú)細(xì)胞濾液腦室內(nèi)注射還是神經(jīng)干細(xì)胞腦室內(nèi)移植都同樣能促進(jìn)谷氨酸鹽誘導(dǎo)的成年小鼠興奮性神經(jīng)元損傷的修復(fù)。Moriyama 等［20］研究表明NSCs 移植能增加體內(nèi)BDNF、ERK 及 CREB 表達(dá)，改善腦缺血后抑郁癥狀。Tfilin 等［21］的研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞注射至大鼠體內(nèi)后能移植至同側(cè)海馬齒狀回，并促進(jìn)該區(qū)域神經(jīng)發(fā)生，并改善大鼠抑郁行為。本研究結(jié)果提示，大鼠在接受神經(jīng)干細(xì)胞治療后，體重較模型組顯著性升高，行為學(xué)指標(biāo)糖水偏好度、垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)、水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)較模型組均有明顯改善。此結(jié)果說(shuō)明局部注射神經(jīng)干細(xì)胞可改善大鼠的抑郁行為。

隨著神經(jīng)元再生調(diào)節(jié)機(jī)制研究的不斷深入，為進(jìn)一步探討抑郁癥的發(fā)生機(jī)制以及發(fā)展新型抗抑郁治療藥物提供了新的思路與視角，并且NSCs 的增殖及分化能力使利用神經(jīng)干細(xì)胞替代多種損傷和退行性變的組織細(xì)胞的治療成為可能。本研究通過(guò)對(duì)應(yīng)激性大鼠抑郁癥模型海馬神經(jīng)元修復(fù)治療，探索NSCs 治療應(yīng)激性抑郁癥的有效性及臨床可行性。