韋祖猛 黃衛(wèi)清 趙寧波 廖金花 彭雙鳳 凌 利 徐麗麗△ 李 林△

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006；3.上海凱寶藥業(yè)股份有限公司，上海 201401）

新型冠狀病毒肺炎（新冠肺炎）由β屬冠狀病毒的2019-nCoV感染引起［1］，可通過呼吸道飛沫、密切接觸以及氣溶膠傳播。目前新冠肺炎大流行正以指數(shù)級(jí)速度增長(zhǎng)，被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為國(guó)際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件。目前還未有對(duì)COVID-19的特效抗病毒藥物，而中藥成分多樣，具有多靶點(diǎn)、整體調(diào)節(jié)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，臨床反饋提示中醫(yī)藥治療新冠肺炎療效顯著［2］。痰熱清膠囊是由上海凱寶藥業(yè)股份有限公司研制的中成藥制劑，由5味中藥組成，其中黃芩為君藥，性苦寒，清肺熱，燥濕解毒；熊膽粉和山羊角為臣藥，具有清熱解毒、息風(fēng)止痙、祛痰平喘等作用；金銀花和連翹為佐使藥以助清熱解毒、宣透散邪［3］。在抗擊新冠肺炎疫情中，痰熱清注射液在國(guó)家衛(wèi)生健康委、國(guó)家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的第六版、第七版診療方案中被納入重癥、危重癥推薦用藥，而痰熱清膠囊則在部分省市的診療方案中被列為輕癥推薦用藥［4-5］。目前由上海市公共衛(wèi)生臨床中心負(fù)責(zé)的《痰熱清膠囊治療新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）臨床試驗(yàn)》（注冊(cè)號(hào)ChiCTR2000029813）正在進(jìn)行，以評(píng)價(jià)痰熱清膠囊治療新冠肺炎有效性及安全性。本研究擬借助于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接的研究方法對(duì)痰熱清膠囊治療新冠肺炎的潛在活性成分及作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)，以期為該藥治療新冠肺炎提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 痰熱清膠囊主要活性成分篩選 在CNKI、萬(wàn)方、維普及中國(guó)生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中以“痰熱清膠囊”以及主要組成藥物為主題，“活性成分”為全文搜索關(guān)鍵詞，檢索痰熱清膠囊已見于文獻(xiàn)報(bào)道的化學(xué)成分。通過Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)檢索藥物成分的2D分子結(jié)構(gòu)，以SDF格式保存，構(gòu)建痰熱清膠囊小分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)。將分子結(jié)構(gòu)的SDF文件導(dǎo)入SwissADME平臺(tái)（http：//www.swissadme.ch/）進(jìn)行類藥性及口服生物利用度分析。同時(shí)，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道中經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有藥理活性的藥物組分，經(jīng)分析后獲取痰熱清膠囊的主要活性成分。

1.2 主要成分及疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 將成分分子結(jié)構(gòu)的SDF文件導(dǎo)入SwissTargetPrediction平臺(tái)（http：//www.swisstargetprediction.ch/）進(jìn)行成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，獲取藥物成分靶點(diǎn)。在 GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中以“Novel coronavirus pneumonia”為關(guān)鍵詞檢索疾病相關(guān)的基因。

1.3 藥物-成分-靶點(diǎn)通路及核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建運(yùn)用R語(yǔ)言將主要活性成分的相關(guān)靶標(biāo)蛋白基因名稱進(jìn)行統(tǒng)一。經(jīng)Excel2019規(guī)范處理后導(dǎo)入Cytoscape3.7.0構(gòu)建藥物、成分、靶點(diǎn)互助網(wǎng)絡(luò)。將藥物與疾病的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String11.0數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//stringdb.org/）獲取靶標(biāo)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)，并借助Cytoscape3.7.0軟件進(jìn)行可視化。

1.4 核心靶點(diǎn)通路分析 為進(jìn)一步了解核心靶點(diǎn)基因的功能和痰熱清膠囊治療病毒性肺炎的主要作用通路，借助R語(yǔ)言對(duì)藥物成分靶點(diǎn)與疾病相關(guān)基因取交集。然后將交集基因輸入Metascape平臺(tái)（https：//metascape.org/gp/index.html）的“Multiple Gene list”的功能界面，物種選定為“H.sapiens（human）”，進(jìn)行 GO功能注釋及KEGG通路富集分析，結(jié)果借助R語(yǔ)言可視化。

1.5 分子對(duì)接 冠狀病毒的3CL水解酶為冠狀病毒的主要蛋白酶之一，與病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)，可作為藥物設(shè)計(jì)的關(guān)鍵靶標(biāo)［6］。目前上海科技大學(xué)饒子和、楊海濤課題組公布了COVID-19 3CL水解酶的X射線晶體結(jié)構(gòu)（PDB 6LU7）。本研究從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org/）下載該晶體結(jié)構(gòu)的3D結(jié)構(gòu)，利用PyMol軟件對(duì)蛋白進(jìn)行去水，分離原配體的處理后，在AutoDockTools完成蛋白和原配體的加氫，計(jì)算電荷，保存為相應(yīng)的PDBQT結(jié)構(gòu)文件。從Pubchem下載痰熱清膠囊主要成分及瑞德西韋及氯喹的二維結(jié)構(gòu)的sdf文件，通過ChemBioDraw3D軟件將其全部轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu)的MOL2格式文件。借助AutoDockTools軟件對(duì)MOL2格式的小分子進(jìn)行加氫，計(jì)算電荷，加Root處理后，保存為對(duì)接必備的PDBQT結(jié)構(gòu)文件，完成配體的準(zhǔn)備工作。對(duì)于3CL水解酶蛋白活性口袋的位置，借助POCASA 1.1平臺(tái)（http：//altair.sci.hokudai.ac.jp/g6/service/pocasa/）基于滾動(dòng)探針球的蛋白口袋識(shí)別算法進(jìn)行預(yù)測(cè)，獲得可能性最高的5種預(yù)測(cè)結(jié)果，從中選取與蛋白原配體坐標(biāo)重合度最高的口袋位置。最后運(yùn)行AutoDock進(jìn)行對(duì)接，取能量最低的構(gòu)象為最優(yōu)構(gòu)象，并以3CL水解酶與原配體返回對(duì)接結(jié)果為陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 見表1。文獻(xiàn)檢索共納入87個(gè)藥物成分［7］，經(jīng)SwissADME平臺(tái)篩選后，共獲得痰熱清膠囊的主要活性成分26個(gè)，其中黃芩苷、綠原酸及其異構(gòu)體口服利用度雖較低，但仍以主要化合物而得以保留。將候選成分的2D分子結(jié)構(gòu)導(dǎo)入SwissTargetPrediction平臺(tái)進(jìn)行靶蛋白預(yù)測(cè)，共獲得相關(guān)靶標(biāo)蛋白293個(gè)。

2.2 藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 見圖1。藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)共有324個(gè)節(jié)點(diǎn)和757條邊。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析顯示的平均度值為4.67、平均最短路徑3.5，平均相鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)4.6，網(wǎng)絡(luò)集中度0.3。度值表示預(yù)測(cè)出該成分與作用靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)個(gè)數(shù)，度值越大說明該成分越重要。經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)大于平均度值的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的有68個(gè)，其中藥物成分26個(gè)，靶點(diǎn)42個(gè)；度值排名前10的化合物包括：黃芩素、異綠原酸C、鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸、異綠原酸B、咖啡酸、亮氨酸、苯丙氨酸、膽酸、木樨草苷。此外，度值大于15的化合物還包括既往文獻(xiàn)報(bào)道的主要化合物如黃芩苷、連翹苷。排名前10的靶點(diǎn)包括：AKR1B1、AKR1B10、CA2、CA12、MMP2、ADORA1、CA7、PTGS2、ADRA2A、NOX4。

表1 痰熱清膠囊主要成分

圖1 藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 痰熱清膠囊治療新冠肺炎PPI互作網(wǎng)絡(luò) 見圖2～圖3，表2。根據(jù)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索疾病靶點(diǎn)，得到259個(gè)靶點(diǎn)。運(yùn)用R語(yǔ)言將主要活性成分的調(diào)控靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，得到26個(gè)痰熱清膠囊治療新冠肺炎的靶點(diǎn)。將26個(gè)靶點(diǎn)基因?qū)隨tring平臺(tái)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，核心網(wǎng)絡(luò)圖包含26個(gè)節(jié)點(diǎn)，174條邊，其中節(jié)點(diǎn)表示蛋白，每條邊則表示蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系，線條越多表示關(guān)聯(lián)度越大。靶蛋白平均節(jié)點(diǎn)度值為10，超過平均度值的靶蛋白有15個(gè)，說明這15個(gè)靶蛋白是PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。痰熱清膠囊的藥理作用很可能是通過作用于這些靶點(diǎn)得以發(fā)揮，將度值由高到低排序。

圖2 痰熱清膠囊與新冠肺炎靶點(diǎn)（Vene圖）

圖3 痰熱清膠囊與新冠肺炎核心靶蛋白（PPI網(wǎng)絡(luò)圖）

表2 PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白

2.4 核心靶點(diǎn)通路分析 見圖4。將上述得到的26個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape平臺(tái)進(jìn)行GO及KEGG功能富集分析，所得結(jié)果經(jīng)R語(yǔ)言可視化處理（見圖4A），KEGG通路富集篩選獲得前19條相關(guān)通路，涉及PI3K-Akt信號(hào)通路、人乳頭瘤病毒感染、MAPK信號(hào)通路、甲型流感、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、TNFα信號(hào)途徑、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等。GO功能富集分析后獲得相關(guān)條目50條（見圖4B、C、D）。GO-BP涉及炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、病毒生命周期、病毒入侵宿主細(xì)胞、免疫反應(yīng)激活、T細(xì)胞活化、中性粒細(xì)胞介導(dǎo)免疫、免疫反應(yīng)中細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié)、MAPK級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)等。GO-CC涉及膜筏、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、溶酶體、質(zhì)膜外側(cè)、細(xì)胞-基質(zhì)粘附連接等。GO-MF涉及病毒受體活性、受體配體活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、MAP激酶活性、磷脂酰肌醇3激酶活性等。

圖4 KEGG富集分析（A）、GO生物學(xué)過程分析（B）、GO細(xì)胞組分分析（C）、GO分子功能分析（D）

2.5 分子對(duì)接結(jié)果 見表3。一般認(rèn)為配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時(shí)能量最低，發(fā)生的作用可能性最大。分子對(duì)接結(jié)果顯示，原配體的最優(yōu)結(jié)合能為-6.77 kcal/mol，瑞德西韋及氯喹的結(jié)合能分別為-7.46、-7.04 kcal/mol。將網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲋卸戎荡笥?5的藥物成分進(jìn)行對(duì)接，其中結(jié)合能低于-8 kcal/mol藥物成分共有6個(gè)。

表3 代表性成分及臨床推薦化學(xué)藥物與2019-nCoV 3CL水解酶的結(jié)合能

3 討論

新冠肺炎傳染性強(qiáng)，傳播迅速，人群廣泛易感，屬于中醫(yī)學(xué)“疫病”范疇。目前學(xué)者普遍認(rèn)為濕毒是本病的關(guān)鍵，同時(shí)極易變?cè)?、化熱、傷陰，由于區(qū)位氣候的差異，又有濕溫、寒濕、濕毒夾燥等證候特點(diǎn)［8-10］。痰熱清膠囊具有燥濕解毒、清熱化痰、宣散透邪之效，可用于風(fēng)溫肺熱、濕毒為甚患者的辨證用藥。

本研究運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)發(fā)現(xiàn)熊去氧膽酸、蘆丁、鵝去氧膽酸、漢黃芩苷、木樨草苷、黃芩苷的結(jié)合能普遍低于原配體及臨床上推薦的抗病毒藥物瑞德西韋、氯喹，表明上述6個(gè)成分與COVID-19 3CL水解酶的結(jié)合能力較強(qiáng)，可抑制病毒的復(fù)制，發(fā)揮抗病毒作用。而GO生物學(xué)過程分析亦提示痰熱清膠囊的藥理作用涉及病毒生命周期、病毒入侵宿主細(xì)胞，細(xì)胞組分主要在細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)，分子功能與病毒受體活性相關(guān)，表明痰熱清膠囊的抗病毒作用可能貫穿于病毒入侵、轉(zhuǎn)錄復(fù)制、播散等過程。有研究顯示黃芩素可通過抑制流感病毒的中后期mRNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制或抑制流感病毒的神經(jīng)氨酸苷酶的活性，降低病毒的毒力而發(fā)揮抗病毒作用［11］。黃芩苷作為黃芩的主要成分以及黃芩素在人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，有抑菌、抗氧化、抗病毒的作用，有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃芩苷可作用于甲型流感病毒的核蛋白轉(zhuǎn)錄過程，負(fù)性調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮抗病毒作用［12］。鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸熊膽粉水解提取物的主要成分，現(xiàn)代藥理表明其具有抑菌、抗病毒、消炎的作用［13］。木樨草苷作為金銀花的黃酮類有效成分，研究顯示對(duì)呼吸道合胞體病毒有很強(qiáng)的抗病毒活性［14］。

機(jī)體免疫系統(tǒng)過度激活及促炎因子大量釋放引發(fā)的“炎癥風(fēng)暴”被認(rèn)為是新冠肺炎重癥化的重要誘因［15］。PPI互助網(wǎng)絡(luò)顯示TNF-α及IL-2是痰熱清膠囊活性成分的重要靶點(diǎn)，KEGG通路富集分析涉及TNF-α、IL-17及NF-κB信號(hào)通路。其中TNF-α是重要的促炎癥因子［16］，IL-2被稱為T細(xì)胞生長(zhǎng)因子（TCGF），對(duì)于調(diào)控體內(nèi)淋巴細(xì)胞功能和穩(wěn)態(tài)起重要作用［17］。蘆丁、綠原酸及其異構(gòu)體作為痰熱清膠囊中良好的抗氧化劑，可對(duì)抗炎癥過程中大量ROS釋放對(duì)肺組織的氧化損傷，同時(shí)抑制ROS對(duì)NF-κB的活化，減少促炎因子的釋放，起到抗炎作用［18-20］。此外GO生物過程分析還涉及T細(xì)胞活化、中性粒細(xì)胞介導(dǎo)免疫、免疫反應(yīng)中細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)，亦可作為痰熱清膠囊調(diào)節(jié)免疫及炎癥反應(yīng)的佐證。

EGFR是受體酪氨酸激酶EerbB家族成員，目前認(rèn)為在炎癥因子如TNF-α、IL17等的刺激下可導(dǎo)致EGFR磷酸化而激活下游的ERK、p38MAPK信號(hào)通路，上調(diào)黏蛋白5AC（MUC5AC）的表達(dá)，導(dǎo)致黏蛋白過度分泌，痰液黏稠度升高［21-22］。目前新冠肺炎患者遺體解剖報(bào)告指出死亡患者肺內(nèi)滲出性反應(yīng)明顯，肺腔內(nèi)見大量膠凍狀黏液痰［23］。有研究表明，黃芩的提取物且同為痰熱清膠囊有效成分的野黃芩苷（Scutellarin）可通過抑制由人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（HNE）誘導(dǎo)的PKC-ERK信號(hào)傳導(dǎo)途徑激活，下調(diào)MUC5AC的表達(dá)，減少氣道黏膜黏液的分泌［23］。因此，推測(cè)痰熱清膠囊可能通過減少炎癥因子的釋放以及抑制EGFR、ERK、p38MAPK的活化而下調(diào)黏蛋白的表達(dá)從而減少滲出、降低痰液黏稠度，促進(jìn)痰液排出。

綜上，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接方法證實(shí)痰熱清膠囊通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療新冠肺炎，其涉及的機(jī)制包括抗病毒、下調(diào)炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、調(diào)節(jié)氣道黏液分泌等，可為痰熱清膠囊治療新冠肺炎及下一步的實(shí)驗(yàn)提供參考。鑒于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及虛擬對(duì)接的局限性，后期還需通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證本次研究結(jié)果，以期為痰熱清膠囊治療新冠肺炎提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。