羅植允 黎燚華 趙新軍 褚慶民 羅川晉 都治伊 康 亮 李 榮△

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州510405）

病態(tài)竇房結(jié)綜合征（SSS）是多種病因?qū)е赂]房結(jié)的起搏和傳導(dǎo)功能發(fā)生改變，從而引起以多種心律失常為特征的臨床綜合征，嚴(yán)重者可導(dǎo)致猝死［1］。植入電子起搏器是目前有效的治療SSS方法，但其屬于有創(chuàng)治療，且價(jià)格昂貴，并發(fā)癥常見，故尋求理想、有效的藥物治療仍然是目前SSS研究中的難題。SSS屬于中醫(yī)學(xué)“遲脈癥”“眩暈”“厥證”等范疇，其根本病機(jī)為心腎陽虛，心氣不足，陽氣失展，無力鼓動(dòng)血脈運(yùn)行，治療以溫陽益氣為原則。

參附注射液（SFI）源自中藥名方參附湯，是由紅參、黑附子的有效成分提取而成。參附注射液中黑附子大辛大熱，補(bǔ)火助陽；紅參乃大補(bǔ)元?dú)庵?；二藥合用有益氣溫陽之功，可助氣脈流通及心臟傳導(dǎo)功能的恢復(fù)?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷和烏頭類生物堿是SFI的主要成分［2］，人參皂苷和生物堿能增強(qiáng)竇房結(jié)興奮性，改善竇房、房室傳導(dǎo)［3］，在臨床上可有效治療SSS，且無明顯毒副作用，但具體作用機(jī)制尚未得到闡釋。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)SFI的主要成分人參皂苷及生物堿治療SSS的機(jī)制進(jìn)行分析，旨在為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用提供思路。

1 材料與方法

1.1 SFI中人參皂苷及生物堿成分?jǐn)?shù)據(jù)獲取 利用Pub Med查閱近5年報(bào)道的關(guān)于SFI成分的文獻(xiàn)，搜集SFI中的人參皂苷及生物堿成分?jǐn)?shù)據(jù)，并通過Pub Chem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取具體成分信息，建立成分信息表。

1.2 人參皂苷及生物堿成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 利用SEA（http：//sea.bkslab.org/）、HitPick（http：//mips.helmholtzmuenchen.de/hitpick/cgi-bin/index.cgi?content=help.html）及 Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)各成分的作用靶點(diǎn)。

1.3 SSS疾病靶點(diǎn)獲取和成分-映射靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Gene Cards（https：//www.genecards.org/）檢索病竇綜合征疾病相關(guān)靶點(diǎn)。Gene Cards數(shù)據(jù)庫中每一個(gè)靶點(diǎn)均對(duì)應(yīng)一個(gè)Score值，Score值反映基因與疾病的緊密關(guān)系，并考慮與疾病相關(guān)來源的可靠性。保留Score值大于等于中位數(shù)的靶點(diǎn)，并與成分靶點(diǎn)信息進(jìn)行對(duì)比，構(gòu)建韋恩圖，交集部分靶點(diǎn)即為SFI中人參皂苷及生物堿治療SSS可能的作用靶點(diǎn)，稱為映射靶點(diǎn)。利用Cytoscape軟件構(gòu)建成分-映射靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 映射靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析 利用STRING（https：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫分析靶蛋白的相互作用關(guān)系。最低相互作用閾值設(shè)置為“highest confidence”（0.90），并利用Cytoscape軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5 KEGG通路富集分析 將映射靶點(diǎn)數(shù)據(jù)通過DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行KEGG通路富集分析。設(shè)定P＜0.01，按照涉及的基因數(shù)目（Count）從大到小排序，篩選排名前20的KEGG通路。

2 結(jié) 果

2.1 SFI中人參皂苷及生物堿的成分信息 見表1。通過文獻(xiàn)查閱，共獲得了SFI 24個(gè)人參皂苷和22個(gè)生物堿成分［4-10］。

2.2 人參皂苷及生物堿成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn) 通過SEA、HitPick、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫獲得成分靶點(diǎn)300個(gè)，其中人參皂苷類靶點(diǎn)200個(gè)、生物堿類靶點(diǎn)125個(gè)。

2.3 SSS疾病靶點(diǎn)獲取和成分-映射靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過Gene Cards數(shù)據(jù)庫共獲得SSS相關(guān)靶點(diǎn)641個(gè)，按照靶點(diǎn)的Score值≥中位數(shù)（7.6）為篩選條件，共得到疾病靶點(diǎn)318個(gè)。將疾病靶點(diǎn)與成分靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)成分與疾病交集靶點(diǎn)47個(gè)，其中人參皂苷與SSS交集靶點(diǎn)33個(gè)，生物堿與SSS交集靶點(diǎn)20個(gè)，見圖1。PI3KCA、REN、AKT1、MTOR、AGTR1、SLC6A4為3者共同映射靶點(diǎn)。

表1 SFI中人參皂苷與生物堿的成分信息

圖1 人參皂苷、生物堿與SSS映射靶點(diǎn)圖

成分-映射靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)見圖2。節(jié)點(diǎn)的自由度越大說明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要。自由度排名前5的成分為人參皂苷Rh4、人參皂苷Rk3、準(zhǔn)噶爾烏頭堿（songorine）、烏頭堿（aconitine）、烏頭原堿（aconine）。

圖2 成分-映射靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

此外，靶點(diǎn)Score值反映了疾病靶點(diǎn)的重要性及其來源的可靠性。在網(wǎng)絡(luò)中，SCN5A（Score=151.42）與準(zhǔn)噶爾烏頭堿有作用關(guān)系，提示準(zhǔn)噶爾烏頭堿可能通過作用于SCN5A而對(duì)SSS起作用；KCNH2（Score=32.25）與10個(gè)生物堿成分（占比50%）有作用關(guān)系；VEGFA（Score=24.51）與22個(gè)人參皂苷類成分（占比96%）有作用關(guān)系，見圖3。因此我們推測(cè)，SFI中人參皂苷類及生物堿類成分通過作用于VEGFA、SCN5A、KCNH2治療SSS的可能性較大。

圖3 關(guān)鍵化合物與靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)圖

2.4 映射靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建成分與疾病映射靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò) 見圖4。網(wǎng)絡(luò)中共有40個(gè)節(jié)點(diǎn)，88條邊，說明在SFI治療SSS的作用靶蛋白之間存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系。自由度值前5的靶點(diǎn)為PIK3CA、STAT3、SRC、AKT1、VEGFA，推測(cè)這些靶點(diǎn)可能是 SFI治療SSS的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

圖4 映射靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 人參皂苷、生物堿治療SSS的KEGG通路分析 根據(jù)P＜0.01共確定了43條KEGG通路，Count排名前20的通路見圖5。由圖中可以看出，SFI成分主要通過調(diào)節(jié)HIF-1信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、RAP1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、RAS信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等起到治療SSS的作用。

圖5 映射靶點(diǎn)KEGG通路分析

2.6 人參皂苷、生物堿治療SSS的協(xié)同作用分析 人參和附子在治療SSS過程中并不是單獨(dú)起作用，而是一個(gè)協(xié)同增效的過程。筆者將人參皂苷與SSS交集靶點(diǎn)及生物堿與SSS交集靶點(diǎn)分別進(jìn)行KEGG通路富集，發(fā)現(xiàn)人參皂苷和生物堿能共同調(diào)節(jié)HIF-1信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路等，見圖6。

3 討論

圖6 人參皂苷、生物堿靶點(diǎn)的共同KEGG通路

SSS的發(fā)病機(jī)制與心肌細(xì)胞膜上離子通道的改變、竇房結(jié)細(xì)胞減少及竇房結(jié)結(jié)構(gòu)重塑密切相關(guān)［11］，而目前多項(xiàng)研究已證實(shí)了SFI對(duì)于SSS的治療有效性。在本研究中，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，筆者發(fā)現(xiàn)SFI可能是通過作用于SCN5A、KCNH2、VEGFA等與SSS關(guān)系密切的靶點(diǎn)而發(fā)揮治療作用的。研究發(fā)現(xiàn)，SCN5A編碼心肌細(xì)胞膜上Na+通道、KCNH2編碼Kv11.1通道，兩者的突變或缺失均可使離子通道異常，導(dǎo)致傳導(dǎo)時(shí)間延長，從而引起心律失常［12-13］；VEGFA是血管內(nèi)皮生長因子家族的成員，VEGF在竇房結(jié)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)育中發(fā)揮重要作用，能促進(jìn)缺血心肌組織血管再生和側(cè)支循環(huán)的建立［14］。通過成分-映射靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)可以發(fā)現(xiàn)，準(zhǔn)噶爾烏頭堿與SCN5A相關(guān)聯(lián)，提示準(zhǔn)噶爾烏頭堿可能通過作用于SCN5A，從而對(duì)心肌細(xì)胞膜上Na+通道起調(diào)節(jié)作用，最終影響SSS的發(fā)生；50%的生物堿成分可作用于KCNH2，提示這些生物堿類可能是通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞膜上Kv11.1通道功能對(duì)SSS起治療作用；同時(shí)，約96%的人參皂苷類成分可作用于VEGFA，這提示促進(jìn)竇房結(jié)及其周圍組織修復(fù)可能是SFI中人參皂苷類化合物發(fā)揮治療效應(yīng)的主要方式。此外SFI治療SSS還與PI3KCA、STAT3、SRC、AKT1等靶點(diǎn)有關(guān)。這些靶點(diǎn)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，研究表明，細(xì)胞凋亡影響著心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)的發(fā)育和成熟，并在竇房結(jié)缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用［15］。

KEGG通路分析提示映射靶點(diǎn)主要富集在HIF-1信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、RAP1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、RAS信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等。HIF-1信號(hào)通路與傳導(dǎo)系統(tǒng)竇房結(jié)、房室結(jié)、浦肯野氏纖維對(duì)缺氧的適應(yīng)有關(guān)［16］。TNF信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在房顫、室性心律失常等疾病的發(fā)生中具有重要作用［17］。雌激素對(duì)心血管系統(tǒng)有保護(hù)作用，雌激素水平減少與女性圍絕經(jīng)期心律失常密切相關(guān)［18］。由此推測(cè)，SFI主要通過以上通路發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)離子通道功能、抑制炎癥反應(yīng)等來治療SSS。

值得注意的是，本研究還發(fā)現(xiàn)人參皂苷和生物堿有共同的作用靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)共同的信號(hào)通路，說明SFI中人參皂苷和生物堿在治療SSS過程中可發(fā)揮協(xié)同作用，這與中醫(yī)藥物相使配伍增效的機(jī)制相契合。

綜上所述，SFI中人參皂苷與生物堿在治療SSS中起協(xié)同作用，涉及調(diào)節(jié)離子通道功能、組織修復(fù)、抑制凋亡和炎癥反應(yīng)等多個(gè)靶點(diǎn)和通路。本研究為SFI治療SSS的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和思路，但其作用機(jī)制仍待進(jìn)一步驗(yàn)證。