韓 靚,劉殿峰,祁明輝,高 偉,王 玲,任文陟,俞先峰,王東旭*,林 超

(1.吉林工商學院,長春 130507; 2.吉林大學動物科學學院,長春 130062)

肺癌是威脅人類健康的重要惡性腫瘤[1-2]。 目前,應用于構建肺癌的動物有小鼠,大鼠,地鼠和狗等[3-4]。 其中,小鼠是目前應用最多的肺癌模型動物[5]。 在誘導小鼠發(fā)生肺癌的過程中,通常選擇一些常見的致癌物質,例如,苯并芘、煤焦瀝青、烏拉坦、氧化钚等[6]。 在肺癌防治相關研究中,烏拉坦誘發(fā)性肺癌模型已得到了較為廣泛的應用,烏拉坦是一種化學致癌物質,由醇與尿素反應形成,主要存在于煙草、煙霧以及發(fā)酵食品,如面包、奶酪中。烏拉坦可以促進小鼠無纖毛呼吸道上皮及Ⅱ型上皮細胞形成肺癌細胞,并且其誘導的肺腺癌病理學特征與人肺腺癌極其相似,從而烏拉坦是作為誘導小鼠肺癌模型較常見的一種藥物[7]。 TET 蛋白家族(ten-eleven-translocation protein)是DNA 甲基化過程中的重要調節(jié)因子,包括TETI、TET2 和TET3,屬于a-酮戊二酸(α-KG)和Fe2+依賴的雙加氧酶。TET 蛋白家族的發(fā)現開辟了表觀遺傳與惡性腫瘤關系研究的新道路,3 種TET 蛋白均可催化5-甲基胞嘧啶(5-metllylcytosine, 5mC)生成5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC),基因突變等因素導致的TET2 蛋白表達量及其催化產物5hmc 含量減少與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[8-9]。 研究發(fā)現,腫瘤組織中TETl 蛋白表達水平與5hmC 含量都有下調的趨勢,這提示增加腫瘤組織中TETl 蛋白表達,以去甲基化激活抑癌基因,或可為腫瘤治療提供新的思路[10-11]。 羥基脈為作用于細胞周期S 期的特異性抗惡性腫瘤藥物,近年來其臨床應用范圍的不斷擴大[12]。 本實驗對烏拉坦誘導的小鼠肺癌模型在給予羥基脲藥物干預后,觀察TETs 蛋白表達對小鼠肺癌模型的影響,為深入研究其機制及尋找肺癌新的治療靶點提供基礎理論和科研實踐。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級雌性ICR 小鼠30 只,6 ～8 周齡,體重22～26 g,購買并飼養(yǎng)于吉林大學實驗動物中心[SCXK(吉)2016-0001]。 飼養(yǎng)環(huán)境溫度為25℃,相對濕度在40%～70%,每日光照為12 h。 小鼠組織取材于吉林大學實驗動物中心[SYXK(吉)2016-0001]。 實驗獲得吉林大學實驗動物倫理委員會的批準(倫理審查證號:201705007),并按實驗動物使用的3R 原則給予人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

烏拉坦(Urethane,Ure,瑞永生物科技有限公司,批號:51-79-6,中國),羥基脲(Hydroxyurea,HU,Sigma-Aldrich,批號:127-07-1,美國),TRIzol reagent(Life Technologies,批號:248204,美國),反轉錄試劑盒(天根,批號:KR116,中國),熒光定量試劑盒(天根,批號:R6508,中國);Western 及IP 細胞裂解液(碧云天,批號:P0013C,中國),PMSF(博士德,批號:AR0162,中國),蛋白定量試劑盒BCA Protein Assay Kit(天根,批號:MA0082-1-Jul-09D,中國),TET1, TET2 和 TET3 抗 體 ( Abcam, 批 號:CC19062119693,CC1712115422,CC1712115423,美國),山羊抗兔,山羊抗鼠二抗(博士德,批號:BST14E05A54,BST14C19B50,中國),切片機(萊卡,批號:RM2015,德國),顯微鏡(奧林巴斯IX71,批號:4M42164,日本),熒光定量PCR 儀(Eppendorf AG,批號:Z237868 J,德國),生物安全柜(上海力申科技有限公司,批號:0117PSQB0186,中國),電子分析天平(梅特勒-托利多,批號:AB204-N,美國),離心機(Thermo,批號:LR56495,美國),電泳儀(君意,批號:JY600C,中國),凝膠成像儀(天能科技,批號:13T12NPFL1-921,中國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組及造模后給藥

參照文獻[13]構建小鼠肺癌模型。 隨機將30 只雌性ICR 小鼠分成3 組,每組10 只。 分別設立Con組,Ure 組和Ure-HU 組。 其中,Ure 組和Ure-HU 組腹腔注射800 mg/kg 烏拉坦溶液,每周2 次,連續(xù)10周。 Con 組注射等量的生理鹽水。 10 周后,停止注射烏拉坦溶液。 對Ure-HU 組腹腔注射500 mg/kg的HU 藥物,連續(xù)21 d。 Con 組和Ure 組注射等量的生理鹽水。 第13 周處死取材。

1.3.2 HE 染色

小鼠處死后,取出腫瘤樣本,進行初步的形態(tài)學鑒定。 將腫瘤樣本進行固定、脫水、透化、浸蠟、石蠟包埋,制備石蠟切片。 石蠟切片進行脫蠟、水洗,并利用蘇木精和伊紅染料進行HE 染色。 最后封片并在鏡下觀察并成像。

1.3.3 基因表達分析

按照說明書,利用TRIzol reagent 提取正常肺組織、腫瘤組織和給藥后腫瘤組織的RNA,RNA 樣品置于-80℃保存。 采用天根快速反轉錄試劑盒將RNA反轉成cDNA,-20℃保存。 根據GeneBank 中基因的原始序列設計下列qPCR 引物,并由吉林省庫美生物科技有限公司合成。 TET1, F: AGCTGGATT GAAGGAACAGG, R: GTCTCCATGAGCTCCCTGAC;TET2,F: AGAGCCTCAAGCAACCAAAA,R: ACATCC CTGAGAGCTCTTGC;TET3,F: TGCGATTGTGTCGAA CAAATAGT, R: TCCATACCGATCCTCCATGAG;HPRT,F: CAGTACAGCCCCAAAATGGT,R: CAAGG GCATATCCAACAACA。

采用熒光定量試劑盒進行實時熒光定量PCR,反應條件按照95℃3 min,(95℃10 s,60℃20 s,72℃30 s)40 個循環(huán),72℃10 min,添加溶解曲線。在實驗中,每一個檢測樣品都設有三個重復。 選擇HPRT 為內參基因。 計算相對表達量時采用2-ΔΔCT公式,樣品數目各為3 個。

1.3.4 蛋白表達分析

利用IP 細胞裂解液對組織進行裂解,BCA 比色法測定蛋白質濃度,取相同質量的蛋白質樣品,加入蛋白質加樣緩沖液,95℃水浴8 min 變性。 配置12%分離膠和5%的濃縮膠,上樣后跑電泳。 利用電轉膜儀進行轉膜。 將轉移了蛋白印跡的PVDF膜浸泡于5% BSA 溶液中,室溫,搖床上封閉1 h。貼膜孵育相應稀釋的抗體,4℃過夜。 加入相應的稀釋二抗(山羊抗兔或者山羊抗鼠),37℃孵育1 h。配置顯色液,采用凝膠成像儀進行觀察并成像。

1.3.5 ELISA 分析

參照《白頭翁總皂苷改善肺癌小鼠肺部微環(huán)境的作用及機制研究》, 檢測小鼠瘤體中VEGF、IL-6和TNF-α 水平。 小鼠處死后,提取正常肺組織、腫瘤組織和給藥后腫瘤組織,采用ELISA 法檢測小鼠瘤體中VEGF、IL-6 和TNF-α 的水平變化。

1.3.6 小鼠自主活動檢測

將小鼠放入主活動記錄儀中,適應2 min。 正式實驗開始后,記錄小鼠5 min 內活動次數,連續(xù)4 d。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行分析小鼠重量,結節(jié)個數,肺重量,生存曲線,自主活動次數以及熒光定量PCR 數據,獨立樣本t 檢驗,P ＜0.05 為差異有顯著性。

2 結果

圖1 小鼠肺癌模型體重、結節(jié)個數、肺重量情況Figure 1 The weight, number of tumors, and lung weight of the mouse lung cancer model

2.1 小鼠肺癌模型的建立

與Con 組相比,連續(xù)給予烏拉坦的Ure 組合Ure-HU 組,在第10 周開始出現體重下降。 其中,與Ure 組相比,Ure-HU 組在進行HU 給藥后,體重下降明顯降低(圖1A)。 第13 周處死小鼠后,收集肺組織,其中Ure 組和Ure-HU 組均發(fā)現不同數目的結節(jié)(圖1B)。 每組隨機統(tǒng)計3 只小鼠肺組織重量,結果顯示,Ure 組和Ure-HU 組與Con 組相比,顯著上升(P ＜0.05)。 與Ure 組相比,Ure-HU 組肺組織重量下降,差異顯著(P ＜0.05)(圖1C)。 生存曲線結果顯示,實驗結束前,Ure 組有2 只小鼠死亡,Ure-HU組有1 只小鼠死亡(圖2A)。 自主活動結果顯示,Ure 組和Ure-HU 組自主活動次數明顯下降(圖2B)。 ELISA 結果證明,與Con 組相比,Ure 組和Ure-HU 組VEGF,IL-6,和TNF-α 水平明顯上升(圖3)。

2.2 形態(tài)學觀察

觀察小鼠肺組織,Ure 組結節(jié)個數多于Ure-HU組(圖4A ～4C)。 與Con 組相比,Ure 組和Ure-HU組,肺部腫大(圖4D)。 HE 染色結果顯示,與Con相(圖5A)比,Ure 組和Ure-HU 組出現明顯肺腺癌病理特征,可見明顯腺圈。 其中Ure 組腺圈內部浸滿腫瘤細胞,排列密集雜亂(圖5B),Ure-HU 組,腺圈內腫瘤細胞較少(圖5C)。

2.3 TETs 蛋白表達模式

熒光定量PCR 結果顯示,與Con 組相比,Ure組和Ure-HU 組TET1,TET2 和TET3 的mRNA 表達水平顯著降低(P ＜0.05)。 經過HU 藥物處理后,TET1 和TET2 的mRNA 水平顯著提高(P ＜0.05)(圖6)。 Western blot 結果顯示,Ure 和Ure-HU 組,TET1,TTE2 和TET3 蛋白表達顯著下降(圖7)。

3 討論

化學致癌試劑烏拉坦誘導的小鼠肺癌模型,是研究肺癌發(fā)病機制和藥物治療最常見的動物模型[14-15]。 之前有文獻報道,利用C57BL/6 小鼠,腹腔注射烏拉坦,連續(xù)15 周,獲得致癌率達到100%的小鼠肺癌模型[16]。 本研究采用ICR 小鼠,每周注射2 次烏拉坦溶液,連續(xù)10 周,所有小鼠肺部均產生病變,表現為結節(jié)出現,肺部腫大,符合小鼠肺癌特征。

之前有研究顯示,烏拉坦誘導的小鼠肺癌模型,肺組織產生明顯腺圈,且隨著腫瘤進程,腺圈內逐漸被腫瘤細胞侵占,腺圈會逐漸消失,腫瘤細胞凝集成團,這與人類臨床晚期肺腺癌病例相似[7,17]。 在本實驗中,病理學切片顯示小鼠肺癌模型中腫瘤細胞成團且腺圈明顯。

圖2 小鼠生存曲線和自主活動情況Figure 2 The survival rate and spontaneous activity of mouse

圖3 小鼠肺癌相關因子的檢測Figure 3 The detection of lung cancer-related factors in mice

圖4 小鼠肺組織形態(tài)學觀察Figure 4 Morphological observation of mouse lung tissue

圖5 小鼠肺組織病理學觀察(HE 染色)Figure 5 Histopathological observation of mouse lung tissue. HE staining

圖6 TET1,TET2 和TET3 的mRNA 表達模式Figure 6 The mRNA expression patterns of TET1, TET2, and TET3

圖7 TETs 的蛋白表達模式Figure 7 The protein expression patterns of TETs

HU 作為一種抗癌藥物,廣泛應用于胃癌,肝癌,白血病等惡性腫瘤中[18-19]。 因此,本研究采用HU 作為治療小鼠肺癌的藥物,觀察小鼠肺部的形態(tài)學變化。 與預期結果相一致,肺癌模型小鼠在經過HU 處理后,結節(jié)個數下降,腫瘤細胞成團個數減少,證明HU 對于小鼠肺癌有抗腫瘤作用。

本實驗進一步分析了TET 家族蛋白在小鼠肺癌的表達模式。 之前有研究表明,TETs 蛋白的表達模式在癌癥中具有重要作用[20]。 例如,TET1 蛋白高表達可以抑制乳腺癌細胞遷移[21]。 也有報道證明TET2 蛋白在血液惡性腫瘤中表達缺失[22-23]。 另外,有證據顯示TET3 在鱗狀上皮細胞癌中可以介導表觀遺傳學修飾失活[24]。 在本實驗中,TET1,TET2 和TET3 在小鼠肺癌樣本中,均呈現低表達的模式,提示TET 家族蛋白在肺癌形成的過程中相關表達水平受到影響。 在經過HU 處理后,TET1 和TET2 蛋白表達上升,這一結果暗示TET 家族蛋白,尤其是TET1 和TET2,在抗腫瘤過程中具有重要作用。

本研究利用抗腫瘤藥物HU 對小鼠肺癌模型進行處理,分析了TET 家族蛋白在體內腫瘤形成后的表達模式。 綜上,提示TETs 蛋白的表達模式及其調控機制在肺癌中具有重要作用。