王平安,楊珂?zhèn)?王 靜,焦 成

(武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司,武漢 430206)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)嚴(yán)重危害著全球人類(lèi)的健康,成為主要死亡原因之一[1]。 目前,人們公認(rèn)的對(duì)AMI 最有效的治療方法是冠狀動(dòng)脈再灌注,但也伴隨著再灌注損傷的問(wèn)題[2]。 對(duì)于心肌缺血再灌注損傷的研究成為了全球的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。 大鼠心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)造模后大鼠的成活率及造模成功率是制約模擬臨床心血管、藥理藥效等方面研究的關(guān)鍵因素之一,但構(gòu)建一套標(biāo)準(zhǔn)的、可持續(xù)操作的心肌缺血模型的制約因素卻有很多[3-4]。 快速操作法和常規(guī)開(kāi)胸法是MIRI 造模的兩種常用方法,但存在開(kāi)胸時(shí)間短對(duì)實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)要求高、術(shù)中出血、氣胸等因素導(dǎo)致模型成功率低下,因此,本研究對(duì)MIRI 造模進(jìn)行改良優(yōu)化,并與這兩種常用的方法進(jìn)行比較,從模型構(gòu)建成功率、大鼠存活率和心肌缺血損傷等方面探討改良式造模操作的可行性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠45 只,8 周齡,體重280 ～300 g,由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[SCXK(鄂) 2015-0018]。 本次研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)、建模等均在SPF 級(jí)屏障環(huán)境動(dòng)物房實(shí)驗(yàn)操作間進(jìn)行[SYXK (鄂) 2018-0104],實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用遵循了3R 原則。 所有實(shí)驗(yàn)操作均獲得武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)的審批(批準(zhǔn)號(hào):HLK-20190218-01)。

1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司;TTC 染色劑、伊文思藍(lán)染液均購(gòu)自武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。 呼吸機(jī)購(gòu)自北京北瑞未來(lái)分析儀器有限公司;體視顯微鏡購(gòu)自舜宇光學(xué)科技;心電圖機(jī)購(gòu)自廣州市三銳電子科技有限公司;數(shù)碼相機(jī)購(gòu)自日本Nikon 公司;小動(dòng)物撐開(kāi)器購(gòu)自海德創(chuàng)業(yè)(北京)生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型構(gòu)建

45 只SD 大鼠隨機(jī)分為3 組:快速操作組、常規(guī)開(kāi)胸組、改良組,每組15 只。 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周,自由進(jìn)食,晝夜均衡,溫度23℃～26℃,濕度(50±5)%,術(shù)前12 h 禁食不禁水。

快速操作組:依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[5],采用不使用呼吸機(jī)快速造模方式進(jìn)行造模。 3%的戊巴比妥鈉腹腔注射劑量1.5 mL/kg 腹腔注射[6],止血鉗快速分開(kāi)3～4 肋間,擠出心臟快速結(jié)扎送回胸腔。 用止血鉗把皮膚夾住閉胸后觀察心電圖變化,成功標(biāo)準(zhǔn)T波高聳或倒置,缺血30 min 后松開(kāi)止血鉗,抽出扎線再灌注。 快速縫合胸腔及皮膚。

常規(guī)開(kāi)胸組:依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7],采用開(kāi)胸造模方式進(jìn)行造模。 大鼠麻醉后接呼吸機(jī),常規(guī)開(kāi)口剪斷2 根肋骨,打開(kāi)胸腔充分暴露心臟后行結(jié)扎,在左心耳下方3～4 mm 處左冠狀動(dòng)脈與后降支分叉處用現(xiàn)代標(biāo)準(zhǔn)代碼5-0 無(wú)創(chuàng)傷絲線穿過(guò)左冠脈降支,進(jìn)針深度0.2～0.4 mm,結(jié)扎后30 min 后再灌注,閉胸縫合。

改良組:3%的戊巴比妥鈉腹腔注射劑量1.5 mL/kg 腹腔注射,頸部及胸腔毛發(fā)剪除消毒,頸部中間開(kāi)口1 cm,胸骨舌骨肌止血鉗鈍性分離暴露氣管,顯微剪刀切開(kāi)小口,開(kāi)口不宜過(guò)大,插入呼吸機(jī)插管,呼吸機(jī)參數(shù):(呼吸頻率:90 次/min;呼吸比:1∶2;朝氣量:11 cc)生理鹽水棉球蓋住創(chuàng)口。 于第3、4 肋骨間(可手按胸腔感知心臟跳動(dòng)最明顯位置)皮膚開(kāi)口1 cm,下行處有一條小靜脈可兩端止血鉗夾住10 s,剪刀剪斷,肋間開(kāi)小口0.5 cm(圖1a)。 2 個(gè)撐開(kāi)器上下左右以肋骨配合撐開(kāi),可見(jiàn)心臟,止血鉗挑開(kāi)心包膜,再夾住胸腺部位固定,另一只手持針(5-0 縫合線,3×8 圓針)左心耳下方3 mm 處進(jìn)針(圖1b)。 深度1 mm,寬度2 mm(圖1c)扎針進(jìn)線后在上方放一根線徑0.53 mm,長(zhǎng)5 cm 魚(yú)線,活結(jié)結(jié)扎(圖1 d 和圖1e)。 縫合閉胸,30 min 后輕抽魚(yú)線再灌注(圖1f)。 以上3 組術(shù)后給予80 萬(wàn)青霉素0.5 mL/只抗炎。 分別于實(shí)驗(yàn)后24 h 和1 周取材心臟。

1.3.2 觀測(cè)指標(biāo)

通過(guò)測(cè)量Ⅱ?qū)?lián)心電圖同步監(jiān)測(cè)大鼠結(jié)扎30 min 后的心電圖表現(xiàn),并與術(shù)前標(biāo)準(zhǔn)的Ⅱ?qū)?lián)心電圖比較,觀察大鼠心電圖有無(wú)再灌注心律失?，F(xiàn)象。

1.3.3 心臟TTC+伊文思藍(lán)染色

缺血再灌注24 h 和1 周結(jié)束后,右側(cè)頸內(nèi)靜脈內(nèi)注入1%伊文思藍(lán)1 mL。 待鼠口唇藍(lán)染后,取下心臟,剔除心房心耳,-20℃速凍約20 min,便于切片。 平行房室溝將左室切成1.5 ～2 mm 厚的切片。切片入TTC 染液(2%)避光浸染,30℃避光孵育15～30 min,邊孵育邊觀察樣本顏色變化。 切片入10%中性福爾馬林中固定24 h。 吸干組織表面液體,并將組織表面多余的染色液沖洗掉,此時(shí)可肉眼觀察并立即拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料采以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( ˉx ±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 大鼠MIRI 造模改良方法Figure 1 An improved method for establishing a rat model of MIRI

圖2 結(jié)扎前后大鼠心電圖變化Figure 2 Changes of electrocardiogram in rats before and after ligation

2 結(jié)果

2.1 造模成功心電圖表現(xiàn)

大鼠結(jié)扎后心電圖ST 段出現(xiàn)抬高,表現(xiàn)出心律失?，F(xiàn)象,提示心肌缺血再灌注大鼠模型構(gòu)建成功,見(jiàn)圖2。

2.2 模型存活率和成功率比較

記錄三組大鼠的存活和造模成功情況,比較各組間的存活率和造模成功率:快速操作組7 只大鼠死亡,存活率為53.33%,3 只造模失敗,造模成功率為33.33%;常規(guī)開(kāi)胸組5 只大鼠死亡,存活率為66.67%,2 只造模失敗,造模成功率為53.33%;改良組2 只大鼠死亡,存活率和造模成功率均為86.67%。

2.3 MIRI 大鼠心肌損傷的病理情況比較

采用TTC+伊文思藍(lán)染色對(duì)三種方式造模24 h及1 周后各組大鼠心肌缺血、梗死面積進(jìn)行觀察。如圖3 所示,造模24 h 及1 周后,快速操作組大鼠受手術(shù)視野結(jié)扎位置所限,缺血梗死面積不統(tǒng)一,快速操作組大鼠受灌注材料方法不同的影響,缺血梗死面積厚度不統(tǒng)一,而改良組大鼠由于手術(shù)視野開(kāi)闊,結(jié)扎位置統(tǒng)一,缺血梗死面積較為統(tǒng)一。

圖3 TTC+伊文思藍(lán)染色觀察造模后大鼠心肌缺血、梗死面積Figure 3 Observation of myocardial ischemia and infarct size in rats by TTC+Evans blue staining

3 討論

AMI 在發(fā)達(dá)國(guó)家有著“頭號(hào)殺手”的稱(chēng)號(hào),而隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展以及生活方式的西化,使得我國(guó)AMI 的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)出逐年遞增的趨勢(shì)[8]。 當(dāng)心肌缺血時(shí),其代謝模式和超微結(jié)構(gòu)均發(fā)生變化,恢復(fù)缺血部分的血流量是常用的治療策略,然而,當(dāng)血流量恢復(fù)時(shí)則易導(dǎo)致MIRI 的發(fā)生[9]。 MIRI 的概念是由Jennings 等[10]根據(jù)組織細(xì)胞缺血后獲得血液再灌注時(shí),組織細(xì)胞缺血所造成的損傷并未得到減輕和恢復(fù),反而加重的病理變化而首次提出的。 MIRI 動(dòng)物模型的成功建立可為MIRI 的臨床治療以及藥物開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),MIRI動(dòng)物模型的構(gòu)建研究具有重大的意義,其構(gòu)建方法多樣,但也存在著相應(yīng)的局限性。

快速操作法及常規(guī)開(kāi)胸造模是目前廣泛應(yīng)用于心肌缺血再灌注模型的造模方法,具有操作較快、方便、視野開(kāi)闊等優(yōu)點(diǎn),但由于快速操作法對(duì)于單人手術(shù)操作而言要求較高,胸腔外擠出心臟快速結(jié)扎時(shí)需快速操作,在開(kāi)胸后2 min 內(nèi)完成擠出心臟、穿線等過(guò)程,且缺血時(shí)閉胸難度大,較難將胸腔完全封閉,易氣胸導(dǎo)致大鼠死亡。 在實(shí)際操作過(guò)程中難度較大,不用呼吸機(jī)協(xié)助死亡率較高。 而常規(guī)開(kāi)胸法因剪斷肋骨開(kāi)口不整齊,在術(shù)后的縫合難度大,縫合線稍緊胸腔坍塌壓迫肺呼吸,導(dǎo)致呼吸困難,易氣胸,且缺血梗死面積較不一致,為后續(xù)的指導(dǎo)臨床研究、藥效評(píng)價(jià)、細(xì)胞治療等研究帶來(lái)諸多不利因素。 因此,需要尋找一個(gè)快速、高成功率、低死亡率的造模方法。

用于構(gòu)建MIRI 模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類(lèi)較多,根據(jù)接近人體病理生理的原則對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行選擇,在進(jìn)化關(guān)系上接近人類(lèi),基因背景清楚、繁殖周期短、模型重復(fù)率高的大鼠在模型制備上具有一定的優(yōu)勢(shì)[11]。 本次研究選擇SD 大鼠作為MIRI 模型構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,在以往造模方法的操作上進(jìn)行改良,并與上述兩種常用方法進(jìn)行比較。 相較于傳統(tǒng)方法,經(jīng)改良后的再灌注在出血量、創(chuàng)傷、呼吸順暢、手術(shù)視野、操作難度等方面均有較大改善。 因開(kāi)口由二個(gè)撐開(kāi)器配合撐開(kāi)胸腔,動(dòng)靜脈小血管沒(méi)有被切斷,出血量微乎其微,墊魚(yú)線縮短了再灌注時(shí)的解線再縫合時(shí)間,避免二次麻醉導(dǎo)致大鼠生理機(jī)能受損,達(dá)到了術(shù)后最好狀態(tài)。 閉胸縫合后胸腔完整度很好,避免出現(xiàn)死腔空腔保證了成功率及成活率,在缺血梗死面積及位置也較為統(tǒng)一。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)大鼠心肌缺血再灌注模型制備過(guò)程中進(jìn)行改進(jìn),與快速操作組和常規(guī)開(kāi)胸組相比,具有更高的造模存活率及成功率,對(duì)后期心肌缺血再灌注的模型構(gòu)建具有重要的指導(dǎo)意義。