魏 杰,王 洪,劉甦蘇,賈松華,熊 芮,王辰飛,范昌發(fā),岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院,北京 102629)

Tim基因家族(T cell immunoglobulin and mucindomain containing molecules gene family)是一個通過編碼免疫球蛋白和粘蛋白分子而在Th1、Th2 細胞表面區(qū)別表達的一個基因家族,在機體過敏和腫瘤免疫等疾病中發(fā)揮著重要作用[1-5]。

小鼠的Tim基因家族有8 個成員,Tim4 與人的基因高度相似,但只能表達在APC 表面,在人體中Tim4 卻可以表達于活化的CD4+T 和CD8+T[6-7]。在小鼠中敲入人源化的Tim4 基因能夠更好的研究T 淋巴細胞的調(diào)節(jié)作用,以及與Tim4 關(guān)聯(lián)密切的哮喘等免疫疾病[8]。

對免疫功能和免疫疾病表現(xiàn)通常伴有血象變化,轉(zhuǎn)基因后的hTIM4-EGFP模型鼠與野生型是否存在差異,以及后期應用于感染實驗的血象變化是否來自于基因編輯或是免疫反應,都需要進行血液生理生化指標的前期測定,從而為其應用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

轉(zhuǎn)基因組hTIM4-EGFP與對照組野生型C57BL/6 各18 只,分別有雌性8 只、雄性10 只,SPF級,體重25～30 g,均來自本單位實驗動物資源研究所[SCXK(京) 2017-0005]。 利用自行建立的CRISPR/Cas9 技術(shù)將hTIM4 基因定點敲入野生型C57BL/6 小鼠,胚胎注射、轉(zhuǎn)錄等操作均在屏障環(huán)境中完成[SYXK(京)2017-0013],PCR 檢測陽性即為陽性轉(zhuǎn)基因鼠。 轉(zhuǎn)基因組與對照組均飼養(yǎng)于屏障環(huán)境[SYXK(京)2017-0013]。

滿12 周齡的兩組小鼠,空腹12 h 后,采20 μL眼靜脈抗凝血加入稀釋液中用于測定血液生理指標,取全血分離血清,用于測定血清生化指標。 飼養(yǎng)和實驗操作均按照實驗動物福利倫理3R 原則規(guī)程進行,并經(jīng)中國食品藥品檢定研究院實驗動物福利倫理審查委員會審批(中檢動(福)第(B)021號)。

1.2 主要試劑與儀器

清洗液與溶血劑購自上海東湖生物醫(yī)學有限公司;堿性磷酸酶等生化檢測試劑購自中生北控生物科技股份有限公司。 日本光電Mek7222 血細胞分析儀;日立7080 全自動生化分析儀。

1.3 實驗方法

采用日本光電MEK-7222 K 血球分析儀測定22項血液生理指標,儀器精密度:WBC 2.0%,RBC 1.5%,HGB 1.5%,MCV 1.0%,PLT 4.0%。 生理測定項目分別為:白細胞計數(shù)(WBC)、紅細胞計數(shù)(RBC)、血小板計數(shù)(PLT)、血紅蛋白濃度(HGB)、平均紅細胞體積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白(MCH)、血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細胞壓積(HCT)、平均紅細胞分布寬度(RDW)、白細胞五分類計數(shù)、平均血小板體積(MPV)、血小板壓積(PCT)和血小板分布寬度(PDW)。

采用日立7080 全自動生化分析儀測定12 項血液生化指標:堿性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(CHO)、葡萄糖(GLU)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、肌酐(CREA)、鈣(CA)、磷(P)、總膽紅素(Tbili)。

1.4 統(tǒng)計學方法

按照品種和性別分類整理數(shù)據(jù),用SPSS 軟件作獨立樣本t檢驗統(tǒng)計分析,結(jié)果均以平均數(shù)±標準差( ˉx ±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 生理指標測定結(jié)果

轉(zhuǎn)基因組與對照組在WBC、RBC、HGB、HCT、MCH、RDW、PLT、NEUT、LYM%、NEUT%這10 項指標中存在統(tǒng)計學差異(詳見表1)。 其中,轉(zhuǎn)基因組在WBC、RBC、HGB、HCT、NEUT、NEUT%這6 項指標上顯著低于對照組(P＜0.01),在MCH、RDW、PLT 三項指標上也低于對照組(P＜0.05),在LYM%指標上顯著高于對照組(P＜0.01)。

按照性別比較,轉(zhuǎn)基因雌性組與對照雌性組在WBC、RBC、HGB、HCT、MCH、MCHC、RDW、PLT、PCT、NEUT、LYM 這11 項指標中存在差異(詳見表2)。 其中,轉(zhuǎn)基因雌性組在HCT、PCT、NEUT、LYM四項指標低于對照雌性組(P＜0.05),其余7 項指標上顯著低于對照組雌性(P＜0.01)。 轉(zhuǎn)基因雄性組與對照雄性組在轉(zhuǎn)基因組在WBC、RBC、HGB、HCT、NEUT、NEUT%這6 項指標上顯著低于對照組,在MCH、RDW、PLT 三項指標上也低于對照組(P＜0.05),在LYM%指標上顯著高于對照組(P＜0.01)。 轉(zhuǎn)基因雄性組與對照雄性組在WBC、RBC、HGB、HCT、LYM、NEUT、LYM%、NEUT%這8 項指標中存在差異。 其中,在RBC、HGB、HCT、NEUT、NEUT%五項指標中,轉(zhuǎn)基因雄性組顯著低于對照雄性組(P＜0.01),在WBC、LYM 兩項指標中低于對照雄性組組(P＜0.05),而在LYM%指標上顯著高于對照雄性組(P＜0.01)。

對同組進行組內(nèi)比較,兩組別雌雄間均有7 項指標存在差異。 轉(zhuǎn)基因組雌雄在MCV、MCH、MCHC、RDW、PLT、NEUT、NEUT%存在統(tǒng)計學差異,對照組雌雄間在RBC、HCT、MCV、LYM、NEUT、LYM%、NEUT%存在統(tǒng)計學差異,詳見表2。

表1 hTIM4-EGFP 與C57BL/6 血液生理指標的比較( ˉx ±s,n=18)Table 1 Comparison of blood physiological values of hTIM4-EGFP and C57BL/6 mice

表2 hTIM4-EGFP 與C57BL/6 血液生理指標組間差異與性別差異比較Table 2 Comparison of blood physiological values of hTIM4-EGFP and C57BL/6 mice in different sexes and groups

2.2 生化指標測定結(jié)果

轉(zhuǎn)基因組在ALT、AST、TG、P 這4 項指標上均低于對照組(詳見表3)。 其中,在ALT、TG 和P 這3 項指標上顯著低于對照組(P＜0.01),在AST 上低于對照組(P＜0.05)。

按照性別比較,轉(zhuǎn)基因雌性組與對照雌性組在ALP、CHO、TG 這3 項指標中存在差異(詳見表4)。其中,轉(zhuǎn)基因雌性組在ALP 指標顯著高于對照雌性組(P＜0.01),其余2 項指標低于對照組雌性(P＜0.05)。 轉(zhuǎn)基因雄性組與對照雄性組在轉(zhuǎn)基因組在ALT、AST、P 這3 項指標上均低于對照組。

對同組進行組內(nèi)比較,兩組別雌雄間各有2 項和4 項指標存在差異。 轉(zhuǎn)基因組雌雄在ALP 和CHO 存在顯著差異,對照組雌雄間在ALT、AST、TP、P 指標上存在統(tǒng)計學差異,詳見表4。

3 討論

實驗動物的血液生理生化指標包含了血細胞的分類構(gòu)成、血清蛋白含量、血糖、酶活力等反應機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的生理代謝參數(shù),反映了個體物質(zhì)代謝、能量代謝水平,是判斷動物健康狀態(tài)及遺傳穩(wěn)定性等的標準,其測定受到物種、年齡、性別、環(huán)境、營養(yǎng)狀態(tài)、疾病等因素的影響[9-12]。

表3 hTIM4-EGFP 與C57BL/6 血液生化指標的比較( ˉx ±s,n=18)Table 3 Comparison of serum biochemical values of hTIM4-EGFP and C57BL/6mice

表4 hTIM4-EGFP 與C57BL/6 血液生化指標組間差異與性別差異比較Table 4 Comparison of serum biochemical values of hTIM4-EGFP and C57BL/6 mice in different sexes and groups

6～8 周齡的性成熟小鼠是開展實驗通常選擇的實驗對象,而12 周齡前后,小鼠的骨生物功能才趨于穩(wěn)定,骨髓造血也趨于穩(wěn)定,因此本研究選擇了12 周齡的Tim4 轉(zhuǎn)基因鼠與野生型進行比較分析,能夠在一定程度反映Tim4 基因敲入對生理生化指標的影響[13]。

從測定的生理指標上分析,無論按照同性別比較或總體比較,除LYM%指標,均存在WBC、RBC、PLT 等主要指標在內(nèi)的11 項或9 項指標轉(zhuǎn)基因組低于野生型對照組的情況,整體血生理參數(shù)與野生型差異較大,但LYM 計數(shù)兩者并無明顯差異,所以在LYM%指標上出現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因組高于野生組的情況。 淋巴細胞計數(shù)指標尤其可以為研究與Tim基因有關(guān)的免疫功能提供借鑒。

從測定的生化指標上分析,轉(zhuǎn)基因組在ALT、AST、TG、P 四項指標上均低于野生型對照組;從同性別比較而言,除轉(zhuǎn)基因雌性組的ALP 高于野生型雌性組外,轉(zhuǎn)基因組雌性和雄性分別在ALP、CHO、TG 以及ALT、AST、P 各3 項指標中低于野生型對應性別組,反映出兩者在在肝功、脂代謝以及內(nèi)分泌功能上均可存在一定差異。

無論生理生化指標,均存在組間差異大于組內(nèi)差異。 在周齡、飼養(yǎng)等條件一致的情況下,基因敲入可能是導致生理指標差異的最主要因素[14];由于hTim4 基因的轉(zhuǎn)入可能會帶來血液生理穩(wěn)態(tài)改變、以及調(diào)低肝脂代謝和內(nèi)分泌等。 該測定建立的血液生理和血清生指標背景資料,為hTIM4-EGFP小鼠的應用研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。