蔡松 蔣鋒利 黃茂 史雨宸 陳申達(dá) 孔維鑫 張晶 王金娥 張立山

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠60只，8周齡，體重(300±10)g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006，飼養(yǎng)于東直門醫(yī)院屏障級實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 藥物及試劑

Total RNA Extraction Kit(GenePool/GPQ1801)；mRNA cDNA Synthesis Kit(GenePool/GPQ1803)；mRNA/lncRNA qPCR Kit(GenePool/GPQ1808)；RNA Loading Buffer (5x)；smad3 antibody(CST/9520)；p-smad3 antibody(Abcam/ ab40854)；Actin antibody(Abcam/ ab6276)；Goat Anti-Mouse IgG，HRP(Abcam/ ab6789)；Goat Anti-Mouse IgG，HRP(Abcam/ ab6721)。

1.3 主要儀器

渦旋振蕩儀QL-902(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；離心機(jī)Centrifuge 5415D(德國Eppendorf)；熒光定量PCR儀Line Gene 9600 Plus型(中國Bioer Technology)；分光光度計(jì)NANODROP 2000(美國Thermo scientific)；雙垂直電泳槽MP-8001(中國CAVOY)；轉(zhuǎn)移槽MP-3030(中國CAVOY)；溫控?fù)u床TS-2000A(中國其林貝爾)；電泳儀PP-1150(中國CAVOY)；全景掃描儀(Pannoramic MIDI型)：匈牙利3D HISTECH。

1.4 動物分組

1.5 造模與給藥方法

所有動物在符合清潔級標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室(溫度22～25℃，濕度50%～70%)適應(yīng)飼養(yǎng)3天，造模前一晚禁食不禁水。除A組外各組大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(70 mg/kg)麻醉，參照文獻(xiàn)[7]以5 mg/kg的博來霉素溶液氣管內(nèi)滴入復(fù)制肺纖維化模型。參照人體與動物體表面積的折算系數(shù)[8]，將給藥量按標(biāo)準(zhǔn)體重?fù)Q算成大鼠的每日用藥劑量，C組給藥劑量為150 mg/(kg·d)；D～F組用量定為：D組1.8 g/(kg·d)，E組0.9 g/(kg·d)，F(xiàn)組0.45 g/(kg·d)。除A組外，各組在造模次日開始灌胃給藥，每日1次，以去離子水稀釋至用藥濃度，配制成混懸液，依照1 mL/100 g連續(xù)給藥28天，B組給予等體積的去離子水。

1.6 標(biāo)本采集

給藥28天后進(jìn)行標(biāo)本采集，以3%戊巴比妥鈉(70 mg/kg)腹腔注射麻醉后，將大鼠解剖分離肺組織，取右肺上葉固定于4%多聚甲醛溶液中。取右肺其余部分置于-80℃冰箱保存。

1.7 肺組織病理

將固定的肺組織進(jìn)行常規(guī)脫水處理、石蠟包埋并切片，切片厚度5 μm，行Masson染色，使用全景掃描儀記錄圖像結(jié)果。

1.8 RT-PCR法檢測TGF-β1、Smad3及Collagen I相關(guān)基因表達(dá)

用Total RNA Extraction Kit(DNaseⅠ)試劑盒按說明提取組織樣本中總RNA，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測RNA的完整性。按mRNA cDNA Synthesis Kit試劑盒說明逆反錄合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?。按mRNA/lncRNA qPCR Kit試劑盒說明進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 30秒，(95℃ 5秒，60℃ 30秒)×45個循環(huán)，并在60～95℃進(jìn)行融解曲線分析，按照2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對表達(dá)強(qiáng)度，每個樣本均設(shè)3個重復(fù)。引物設(shè)計(jì)見表1。

1.9 Western blot法檢測Smad3、p-smad3蛋白表達(dá)

按Protein Extraction Kit(GenePool/ GPP1814)試劑盒說明進(jìn)行蛋白提取并進(jìn)行蛋白定量，依照電泳上樣量需要用水及SDS-PAGE Loading Buffer(5×)調(diào)整蛋白濃度，100℃煮沸變性10分鐘備用。配制12%的分離膠，5%濃縮膠。算得待檢測蛋白樣品上樣量80 μg，濃縮膠恒壓80 V，約20分鐘；分離膠恒壓120 V，電泳至溴酚藍(lán)到凝膠底部。在2小時恒流300 mA條件下轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，加入封閉液(BSA/5%milk)于搖床中室溫封閉1小時。將PVDF膜置于雜交袋中，分別加入配制好的一抗4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次5分鐘，加入相應(yīng)稀釋后的二抗，室溫孵育50分鐘。TBST洗膜3次，每次5分鐘。按ECL Plus Western Blot Kit試劑盒說明暗室中曝光，顯影并定影。

條帶灰度值采用Quantity One v.4.6.2軟件進(jìn)行讀取，除以內(nèi)參Actin灰度值，即得樣品中目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量，所有樣本均設(shè)3個重復(fù)。

表1 引物序列表

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 博來霉素致肺纖維化大鼠肺組織病理

A組大鼠肺泡形態(tài)正常，肺泡腔及間質(zhì)未見膠原纖維沉積；B組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)塌陷、融合，肺間質(zhì)增寬，肺組織大面積實(shí)變，實(shí)變區(qū)域及肺泡間隔可見大量明顯亮藍(lán)色的膠原纖維，對比A組說明肺纖維化模型成功；C組、D組可見大小不等的片狀實(shí)變區(qū)，肺泡結(jié)構(gòu)破壞程度較輕，間隔增厚，間質(zhì)膠原沉淀較B組少；E組、F組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)相對完整，纖維化程度也明顯較輕，其中F組的改善更為明顯。見圖1。

2.2 RT-PCR法檢測博來霉素致肺纖維化大鼠TGF-β1、Smad3及Collagen I相關(guān)基因表達(dá)

與A組相比，B～E組大鼠TGF-β1、Smad3及Collagen I的基因表達(dá)均顯著升高(P<0.01)，F(xiàn)組Smad3、Collagen I基因表達(dá)顯著升高(P<0.01)，TGF-β1基因表達(dá)明顯升高(P<0.05)。與B組相比，F(xiàn)組TGF-β1、Smad3的基因表達(dá)均明顯降低(P<0.01)，Collagen I的基因表達(dá)明顯降低(P<0.05)。與C組相比，F(xiàn)組TGF-β1的基因表達(dá)均明顯降低(P<0.01)，Smad3、Collagen I的基因表達(dá)明顯降低(P<0.05)。與F組相比，D組TGF-β1基因表達(dá)明顯升高(P<0.01)，Smad3基因表達(dá)明顯升高(P<0.05)，E組各數(shù)據(jù)無顯著性差異。D、E組各數(shù)據(jù)與B、C組相比均無明顯差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad3及Collagen I相關(guān)基因表達(dá)

2.3 Western blot法檢測博來霉素致肺纖維化大鼠Smad3、p-smad3蛋白表達(dá)

圖1 各組大鼠肺組織Masson染色觀察(×100)

表3 Western blot法檢測各組大鼠Smad3、p-smad3蛋白表達(dá)

圖2 Western blot法檢測各組大鼠Smad3、p-smad3蛋白表達(dá)

3 討論

IPF主要病理變化是成纖維細(xì)胞(fibroblast, FB)大量的增殖和聚集及ECM過度沉積，形成“成纖維細(xì)胞灶”，導(dǎo)致肺結(jié)構(gòu)破壞[9]。而TGF-β1作為調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、發(fā)育和分化的細(xì)胞因子，在纖維化中有重要作用[10]，其在正常肺組織中無表達(dá)，而在纖維化的肺組織中特異性表達(dá)增加[11]。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1能誘導(dǎo)FB轉(zhuǎn)化形成MB，促進(jìn)MB存活，從而影響ECM沉積[12]。Smad蛋白家族是TGF-β1的下游底物分子，TGF-β是ECM產(chǎn)生的有效促進(jìn)劑，而TGF-β1的生物學(xué)活性需要Samd途徑的激活才能發(fā)揮[13]。Smad3作為正向調(diào)節(jié)因子，被TGF-β1的I型受體磷酸化后，與Smad4結(jié)合并進(jìn)入細(xì)胞核參與調(diào)節(jié)如膠原基因等靶基因轉(zhuǎn)錄[14]，TGF-β1/Smad信號通路被激活后，可增加進(jìn)一步促進(jìn)FB增殖轉(zhuǎn)化為MB，同時促進(jìn)EMT過程，減少降解ECM的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)分泌并抑制其活性，同時增加基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMP)的合成與分泌，抑制MB凋亡，從而促進(jìn)ECM沉積[15-16]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)將Smad3基因敲除以干擾TGF-β/Smad信號通路的方法對肺纖維化的臨床前模型有保護(hù)作用[17]，故Smad3在TGF-β介導(dǎo)的Smad途徑中有重要作用。