毛 悅 聶振昌 唐香山

（唐人神集團(tuán)股份有限公司，株洲412000）

大豆作為飼料中主要的植物型蛋白來源，其蛋白含量較高， 對于生長豬而言， 其消化率也較高， 大部分氨基酸的消化率介于80%-90%之間。 但是這些指標(biāo)主要是對于生長豬而言，大豆中也存在較多的抗?fàn)I養(yǎng)因子， 由于早期仔豬的胃腸道發(fā)育不完善， 對植物型蛋白源消化能力較差， 有研究表明大豆中的抗?fàn)I養(yǎng)因子會引起仔豬腸道消化膜損傷， 尤其部分抗原蛋白即使經(jīng)過熱處理也會造成腸道炎癥。 但是大豆經(jīng)過發(fā)芽處理后， 種子內(nèi)部的淀粉、 脂肪以及蛋白質(zhì)會逐步分解， 限制性氨基酸等物質(zhì)的含量也有所提高， 風(fēng)味得到改善。 本實(shí)驗(yàn)主要觀察大豆抗原蛋白的變化， 以利用發(fā)芽大豆作為仔豬植物型蛋白來源提供理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大豆： 地方品種株洲市超市購買； 該實(shí)驗(yàn)所需試劑丙烯酰胺、 Beta-巰基乙醇、 過硫酸銨等均為分析純試劑。

1.2 試劑與儀器

康麗CN-A323B 大豆發(fā)芽機(jī)、 101-2AB 電熱鼓風(fēng)干燥箱箱、 FW-100 手提粉碎機(jī)、 AL204型分析天平、 六一蛋白電泳系統(tǒng)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大豆樣品制備

挑選優(yōu)質(zhì)黃大豆， 清洗， 浸泡， 在發(fā)芽機(jī)內(nèi)加入足夠的水， 室溫下發(fā)芽， 每天澆水一次并取一定量的發(fā)芽大豆樣品， 實(shí)驗(yàn)期維持6 天，樣品選取發(fā)芽第0、 1、 2、 3、 4、 5、 6 天的黃豆， 整株在烘箱內(nèi)55℃烘干， 手提粉碎機(jī)粉碎備用。

1.3.2 SDS-page 試驗(yàn)試劑配制

①樣品浸提液： Tris 3.63 g， Beta-巰基乙醇0.7 ml 定容至1L， 用HCL （HCL： H2O=1:1）調(diào)節(jié)PH 為8.0。 ②30%丙烯酰胺： 丙烯酰胺30 g，雙丙烯酰胺0.8 g， 去離子水定容至100 ml。 ③4×堆 積 膠 緩 沖 液： 1 mol/L Tris-HCL （PH=6.8） 50 ml， 10% SDS 4 ml， 蒸 餾 水46 ml，10%過硫酸銨5 ml。 ④電泳緩沖液： Tris 3 g，甘氨酸 14.4 g， SDS 1 g， 定容至1 L， 調(diào)節(jié)PH 至8.3。 ⑤5×樣品緩沖液： 1 mol/L Tris-HCL(PH=6.8) 0.6 ml， 50%甘油 5 ml， 10% SDS 2 ml， Beta-巰基乙醇0.5 ml， 1%溴酚藍(lán)1 ml，蒸餾水0.9 ml。 ⑥染色液： 考馬斯亮藍(lán)0.25 g，甲 醇45.4 ml， 冰 醋 酸9.2 ml， 去 離 子 水45.4 ml。 ⑦脫 色 液： 甲 醇114 ml， 冰 醋 酸18 ml，去離子水118 ml。

表1 濃縮膠和分離膠配方

1.3.3 SDS-page 電泳

取不同天數(shù)的發(fā)芽大豆烘干樣1 g， 加入20 ml 提取液， 室溫條件下浸泡1 h， 每隔10 min充分混勻， 之后8000 rpm 離心20 min， 取上清液20 μl， 加入40 μl 上樣緩沖液， 沸水浴3 min后8000 rpm 離心5 min。

取樣品處理后上清液上樣， 濃縮膠跑電泳時(shí)電壓穩(wěn)定保持80 V， 分離膠的電壓調(diào)為120 V。電泳結(jié)束后， 小心切去濃縮膠， 放入新鮮染色液染色45 min， 用自來水漂去剩余染液， 直至水流無色， 之后倒入脫色液脫色， 每隔2 h 換一次脫色液， 直至蛋白條帶清晰可見。

2.結(jié)果與分析

2.1 SDS-page 凝膠電泳結(jié)果

如圖1 中標(biāo)識所示α、 α’、 β 是未發(fā)芽大豆中大豆抗原蛋白7 S 的三個(gè)亞基， A1、 A2、 A3、A4、 Basic 是大豆抗原蛋白11S 的五個(gè)亞基。

將大豆發(fā)芽的跑膠圖導(dǎo)入Photoshop 中將圖像全部轉(zhuǎn)換為8 位灰度進(jìn)行處理， 之后導(dǎo)入GelAnalyzer2010a 進(jìn)行前處理， 對應(yīng)對照抗原蛋白特定區(qū)域選取所需泳道以及所需條帶， 得出峰面積結(jié)果， 該區(qū)域峰面積較大則該條帶蛋白含量高。

表2 各亞基占大豆抗原蛋白總量的比例

圖1 大豆發(fā)芽抗原蛋白SDS-page 跑膠結(jié)果圖

圖2 GelAnalyzer 特征抗原條帶峰面積圖

圖3 GelAnalyzer 處理?xiàng)l帶峰面積處理結(jié)果

從SDS-page 凝膠電泳整體情況分析， 如圖3 所示大豆發(fā)芽第1 天至第6 天蛋白條帶都出現(xiàn)明顯降解， 隨著時(shí)間的推移， 大分子蛋白條帶逐漸變淺， 同時(shí)小分子蛋白條帶逐漸增多， 大豆發(fā)芽時(shí)酶的活化最為明顯， 隨著發(fā)芽時(shí)間的延長， 在蛋白酶的作用下， 蛋白質(zhì)含量組成不斷發(fā)生變化， 大分子蛋白含量隨發(fā)芽時(shí)間的延長逐漸降低， 小分子蛋白含量則有所增加， 發(fā)芽期間發(fā)生了蛋白質(zhì)、 氨基酸種類的變化。

根據(jù)峰面積處理結(jié)果圖， α 處發(fā)芽1-5 天蛋白含量處于下降， 第6 天變化不明顯， α’ 處隨著時(shí)間推移慢慢變淺； β 處1-3 天變化緩慢，第3-5 天變化明顯， A3 處均逐步變淺； A1、A2、 A4 處1-3 天變化緩慢， 第3 天-第4 天變化明顯， 4-6 天變化不明顯。 因此對于整體發(fā)芽情況， 7S、 11S 抗原蛋白均有所下降， 下降趨勢基本一致。

大豆發(fā)芽過程是一個(gè)大分子蛋白不斷降解成小分子蛋白的過程， 隨著時(shí)間的推移， 新的蛋白質(zhì)不斷形成， 大豆內(nèi)源蛋白酶的種類隨著時(shí)間的變化而發(fā)生了一系列的變化， 由文獻(xiàn)了解到發(fā)芽1-4 天， 蛋白酶以切割大分子蛋白的內(nèi)切酶為主， 此時(shí)SDS-PAGE 電泳圖中大分子量的蛋白條帶逐漸變淡， 小分子量的蛋白條帶不斷形成； 發(fā)芽4-6 天， 蛋白酶主要作用于一些分子量較小的蛋白， 這一時(shí)期大分子蛋白條帶被繼續(xù)分解至完全消失， 小分子蛋白條帶清晰形成， 結(jié)果基本一致。

3.總結(jié)

本實(shí)驗(yàn)通過大豆發(fā)芽處理， 檢測其大豆抗原蛋白含量的變化。 上述結(jié)果表明， 發(fā)芽后5天其大豆抗原蛋白有了明顯的降解， 考慮到大豆發(fā)芽時(shí)間過長， 一般在6-7 天會開始腐敗，根據(jù)上述結(jié)果與后續(xù)生產(chǎn)效率的要求， 建議大豆在第5 天終止發(fā)芽。

參考文獻(xiàn) （略）