邵 華

（西南政法大學(xué)，重慶 401100）

大球蓋菇（Stropharia rugoso-annulata），別名皺環(huán)球蓋菇、酒紅色球蓋菇或斐氏球蓋菇，是一種珍稀的食用菌。大球蓋菇口感極佳，顏色誘人，富含多種對(duì)人體有益的礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素以及多糖[1]，因此其食用價(jià)值和藥用價(jià)值是毋庸置疑的，開(kāi)發(fā)潛力非常巨大。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織為了扶持發(fā)展中國(guó)家的經(jīng)濟(jì)發(fā)展，推薦了大批具備經(jīng)濟(jì)收益的食用菌栽培品種，大球蓋菇就是其中之一[2]。大球蓋菇中的多糖成分對(duì)增強(qiáng)機(jī)體免疫能力有非常重要的作用，并且可有效作用于病毒、腫瘤等疾病以及消化不良、精神疲勞等方面的治療[3]。相關(guān)學(xué)者研究表明，大球蓋菇多糖的濃度決定了其對(duì)大鼠干線粒體腫脹的抑制功效[4-5]。本研究通過(guò)建立大鼠高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)模型，探討大球蓋菇多糖對(duì)大鼠脾臟相關(guān)細(xì)胞因子、T淋巴細(xì)胞亞群、體重及脾臟指數(shù)差異的影響，為其在運(yùn)動(dòng)保健過(guò)程中的作用提供一定的理論依據(jù)。

1 大球蓋菇多糖的提取過(guò)程

1.1 試劑

大球蓋菇多糖提取所需試劑主要有：95%乙醇、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖、標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖、三氯甲烷、福林一酚試劑、Sephadex G-100、正丁醇、DEAE-Sephadex A-50、Sevag試劑。

1.2 儀器

大球蓋菇多糖提取所需的儀器主要有電熱恒溫水浴鍋，上海赫田科學(xué)儀器有限公司；透析袋，索萊寶科技有限公司；梯度混合儀，上海嘉鵬科技有限公司；常速離心器，普若邁德；恒流泵，天利流體工業(yè)設(shè)備廠；BS-160A型自動(dòng)部分收集器，上海金鵬分析儀器有限公司；722型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精科實(shí)業(yè)有限公司等。

2 提取以及制備方法

2.1 提取方法

將定量的大球蓋菇子實(shí)體粉末經(jīng)過(guò)沉淀后在恒溫水浴鍋中提取出來(lái)，將這一過(guò)程重復(fù)操作3次，提取溫度、醇析濃度、物料比設(shè)計(jì)各不相同，將多種條件下提取出的物質(zhì)離心混合上清液，濃縮成型，用丙酮和乙醇將其清洗兩次然后烘干，便形成了大球蓋菇多糖[5]。

2.2 制備方法

稱(chēng)取100 g大球蓋菇子實(shí)體粉末，加入蒸餾水1 000 mL，在沸水中浸泡1 h，在4 000 r·min-1離心條件下保持15 min，提取上清液，在殘?jiān)屑尤胝麴s水500 mL，在沸水中浸泡1 h，在4 000 r·min-1離心力條件下保持15 min，提取上清液，再次提取殘?jiān)?，上清液在合?次以后濃縮體積在250 mL，加入1 000 mL 95%乙醇靜置一夜。離心后先用80%乙醇清洗3遍，用丙酮再次清洗2遍，烘干以后便是大球蓋菇多糖樣品。

在粗多糖樣品中多次加入80 mL蒸餾水將其溶解，采用seveg法將蛋白脫離出來(lái)，做流水透析24 h，再次加入新的蒸餾水透析12 h，然后加入1 000 mL 95%乙醇沉淀出多糖，離心后將沉淀物烘干并稱(chēng)重，并形成了大球蓋菇精制多糖[6]。

3 大球蓋菇多糖對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞恢復(fù)的影響研究試驗(yàn)

3.1 試驗(yàn)對(duì)象

試驗(yàn)所需SD大鼠30只，周齡為8周，無(wú)疾病，體重差不超過(guò)20 g。這些大鼠均來(lái)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠進(jìn)入試驗(yàn)室之后飼養(yǎng)1周方可用于試驗(yàn)，飼養(yǎng)溫度為26℃左右，相對(duì)濕度為45%～65%。將30只大鼠按照體重的不同平均分為3組，每組10只，分別是對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)干預(yù)組、運(yùn)動(dòng)給藥組。

3.2 大球蓋菇多糖制備方法

試驗(yàn)所用的大球蓋菇均為優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品，統(tǒng)一在河南虞城縣聞集鄉(xiāng)金隆食用菌栽培基地購(gòu)買(mǎi)，按照試驗(yàn)要求清洗之后烘干備用。試驗(yàn)的大球蓋菇多糖提取選用傳統(tǒng)水提法，試驗(yàn)開(kāi)展前期的預(yù)備試驗(yàn)已經(jīng)確定提取工藝，其中料液比為1∶25，溫度為90℃，共提取2次，時(shí)長(zhǎng)為4 h，離心提取上清液，采用Sevag法脫離蛋白，離心之后獲取的大球蓋菇粗多糖加入乙醇沉淀，在真空條件下冷凍直至干燥形成大球蓋菇多糖干粉，并測(cè)定其糖含量[7]。

3.3 試劑及儀器

試驗(yàn)采用的試劑主要有南京建成生物工程研究所研發(fā)的PE-CD8+、FITGCD4+、Percp-CD3+抗大鼠單克隆抗體和IL-10、IFN-γ、TNF-a、IL-6試劑盒；由美國(guó)CST公司生產(chǎn)的p-p38MAPK山羊抗兔試劑盒和p-p38MAPK兔多抗試劑盒。

試驗(yàn)采用的儀器主要有：FSH-2高速電動(dòng)勻漿機(jī)，北京瑞麗分析儀器公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；ZH-PT動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)，淮北正華生物儀器設(shè)備公司；FACSCo unt流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司；電泳儀及iMARK酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Rad公司；H2050R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)公司；Ue1Doc EZ凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司。

3.4 運(yùn)動(dòng)方案及給藥方案制定

3.4.1 運(yùn)動(dòng)方案

對(duì)照組大鼠無(wú)需進(jìn)行日常運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，常規(guī)喂養(yǎng)。運(yùn)動(dòng)干預(yù)組和運(yùn)動(dòng)給藥組大鼠均進(jìn)行9周的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，每周運(yùn)動(dòng)6 d。大鼠在第7周要接受力竭訓(xùn)練。大鼠出現(xiàn)呼吸急促，俯臥垂頭，跑速無(wú)法達(dá)到預(yù)期，長(zhǎng)時(shí)間處在跑臺(tái)尾部位置，通過(guò)聲波和機(jī)械刺激無(wú)效說(shuō)明大鼠力竭。

3.4.2 給藥方案

運(yùn)動(dòng)給藥組大鼠按照體重比例在運(yùn)動(dòng)開(kāi)始前2 h灌胃給藥大球蓋菇多糖懸液；對(duì)照組大鼠和運(yùn)動(dòng)干預(yù)組大鼠則用蒸餾水替代大球蓋菇多糖懸液，為期9周的試驗(yàn)每日給藥1次。

3.5 指標(biāo)測(cè)定及方法

3.5.1 大鼠脾臟指數(shù)及細(xì)胞因子測(cè)定

1）脾臟指數(shù)：大鼠在接受最后1次運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練之后，將大鼠麻醉。為大鼠稱(chēng)體重之后，將大鼠的肝臟取出稱(chēng)其重量，按照公式計(jì)算出脾臟指數(shù)。

2） 細(xì)胞因子：稱(chēng)重之后的大鼠脾臟研磨成粉末，加入一定量的細(xì)胞裂解液；離心之后提取細(xì)胞懸液，將其倒入24孔無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)板中，平均每孔500 μL，放入CO2培養(yǎng)箱中48 h；然后離心10 min獲取上清液，將上清液冷藏于-20℃的冰箱。通過(guò)雙抗體夾心EIISA法分別測(cè)定大鼠脾臟中所含的IL-10、IFN-γ、TNF-a、IL-6量，操作過(guò)程參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

4 試驗(yàn)結(jié)果與分析

4.1 大鼠體重及脾臟指數(shù)差異

各組大鼠體重及脾臟指數(shù)對(duì)比情況見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠體重及脾臟指數(shù)對(duì)比情況Tab.1 Comparison of body weight and spleen index of rats in each group

從表1可以看出，大鼠在經(jīng)過(guò)9周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，對(duì)照組與運(yùn)動(dòng)干預(yù)組大鼠的體重及脾臟指數(shù)相比，運(yùn)動(dòng)干預(yù)組下降明顯；運(yùn)動(dòng)給藥組與運(yùn)動(dòng)干預(yù)組大鼠的體重及脾臟指數(shù)相比，運(yùn)動(dòng)干預(yù)組下降明顯。說(shuō)明運(yùn)動(dòng)給藥組大鼠情況良好。

4.2 大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群差異

各組大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群的對(duì)比情況見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群的對(duì)比情況Tab.2 Comparison of T lymphocyte subsets in spleen of rats in each group

從表2中可以看出，對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)給藥組的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+相比，運(yùn)動(dòng)干預(yù)組降低幅度大；運(yùn)動(dòng)干預(yù)組和運(yùn)動(dòng)給藥組的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+相比，運(yùn)動(dòng)干預(yù)組降低幅度大。說(shuō)明運(yùn)動(dòng)給藥組大鼠情況良好。

4.3 大鼠脾臟細(xì)胞因子差異

各組大鼠脾臟細(xì)胞因子變化情況見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠脾臟細(xì)胞因子變化情況Tab.3 Changes of cytokines in spleen of rats in each group

從表3可以看出，對(duì)比3組大鼠脾臟IL-10、IFN-γ、TNF-a、IL-6含量發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)干預(yù)組大鼠IL-10含量明顯降低，IFN-γ、TNF-a、IL-6含量明顯升高，表明運(yùn)動(dòng)干預(yù)組大鼠的運(yùn)動(dòng)免疫系統(tǒng)出現(xiàn)紊亂；運(yùn)動(dòng)給藥組大鼠在服用大球蓋菇多糖之后，與運(yùn)動(dòng)干預(yù)組相比IFN-γ、TNF-a、IL-6含量明顯偏低，IL-10含量明顯升高，且差異顯著，這就表示大球蓋菇多糖對(duì)高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練大鼠的脾臟免疫系統(tǒng)有很好的保護(hù)作用[8]。

5 討論

脾臟是細(xì)胞免疫因子的主要聚集場(chǎng)所，他們控制分泌并發(fā)揮作用，可有效調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)，控制機(jī)體炎癥發(fā)生[9]。細(xì)胞因子作用于免疫系統(tǒng)時(shí)，分為兩個(gè)類(lèi)別，分別是促炎因子和抗炎因子。促炎因子中主要有IFN-γ、TNF-a、IL-6等，可以增強(qiáng)炎性的發(fā)生，對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)造成損傷；抗炎因子主要有IL-4、IL-10等，可以有效抑制炎性的發(fā)生，形成對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的保護(hù)屏障[10]。相關(guān)研究結(jié)果顯示，長(zhǎng)期高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后機(jī)體的促炎因子更加活躍，抗炎因子受到限制，對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)會(huì)造成損害[11]。本試驗(yàn)研究表明，大球蓋菇多糖對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠脾臟促炎因子IFN-γ、TNF-a、IL-6有抑制作用，對(duì)抗炎因子IL-10有促進(jìn)作用?？梢杂行д{(diào)節(jié)和保護(hù)大鼠免疫系統(tǒng)的平衡。

機(jī)體免疫功能還有一個(gè)重要指標(biāo)就是T淋巴細(xì)胞，長(zhǎng)期高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)也會(huì)對(duì)T淋巴細(xì)胞中的CD3+、CD4+、CD8+等細(xì)胞造成影響。CD3+、CD4+、CD8+對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的作用各不相同，共同維護(hù)機(jī)體免疫功能，CD4+/CD8+比值是顯示機(jī)體免疫功能是否正常運(yùn)轉(zhuǎn)的指標(biāo)[12]。有相關(guān)研究就高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)T淋巴細(xì)胞的影響做出說(shuō)明，高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)影響脾臟健康最終導(dǎo)致淋巴細(xì)胞分泌不足[13]。此次研究中運(yùn)動(dòng)給藥組大鼠在服用大球蓋菇多糖之后，CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8均優(yōu)于運(yùn)動(dòng)干預(yù)組，說(shuō)明大球蓋菇多糖可有效保護(hù)脾臟健康，維護(hù)T淋巴細(xì)胞分泌。

研究結(jié)果表明，大球蓋菇多糖可有效作用于高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練大鼠的脾臟健康，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)平衡，也就說(shuō)明大球蓋菇多糖對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞恢復(fù)有積極作用。