胡建平

（慶元縣食用菌科研中心，浙江 慶元 323800）

菌種保藏方法多樣，常通過控制溫度、氧氣和營養(yǎng)等食用菌菌絲生長要素達到菌種保藏的目的。食用菌菌種有多種保藏方法，如適用于所有食用菌菌種保藏的瓊脂斜面低溫保藏法，適合于雙孢蘑菇 （Agaricus bisporus）、香菇 （Lentinus edades）等菌種長時間保藏的液氮超低溫保藏液法[1]，以及適用于保藏孢子的濾紙片保藏法、沙土管保藏法、冷凍干燥保藏法等[2]。通過簡述設備簡單、操作方便的瓊脂斜面低溫保藏菌種方法，為中、小型食用菌企業(yè)提供一定的技術(shù)支持。

1 試管斜面制備方法

1.1 培養(yǎng)基配方（PDA）

馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，自來水1 000 mL，pH自然。

1.2 制備流程

1.2.1 培養(yǎng)基制作

將馬鈴薯洗凈去皮，稱取200 g，切小塊，加水煮爛（煮沸20 min～30 min，馬鈴薯塊能被玻璃棒戳破即可），用8層紗布過濾，取下清液加熱，加入瓊脂20 g，繼續(xù)加熱攪拌混勻，待瓊脂溶解后，加入葡萄糖，攪拌均勻，稍冷卻后再補足水分至1 000 mL，分裝試管[3]。

1.2.2 加塞棉塞

加塞時，使棉塞長度的1/3在試管口外，2/3在試管口內(nèi)，松緊適中（拔出棉塞時有輕微的“嘭”聲則較為合適）。做塞的綿花纖維需較長，一般不用脫脂棉。

1.2.3 滅菌

試管用高壓滅菌鍋115℃滅菌20 min，待降溫至60℃左右，取出試管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆谩Ｐ杞?jīng)常用斜面轉(zhuǎn)管及生產(chǎn)時，可以制作擺斜面用的木盒，見圖1。

如圖1所示，木盒有底和3個側(cè)面，木盒寬應比試管略短，長度以正好可放20.5支試管為宜，高以可放10層左右試管為宜。木盒長邊空缺一面外沿要固定有高約1.5 cm，寬約2 cm木條用于擺斜面。

2 無菌操作

接種前要準備滅過菌的棉花，一起放入無菌室內(nèi)，以便在所用棉塞受潮時更換；接種操作需在酒精燈火焰的無菌區(qū)完成，切勿使試管口、瓶口離開無菌區(qū)，盡量在超凈工作臺內(nèi)操作；操作時試管口、瓶口略向下，以減少雜菌污染。接種時，操作人員應少走動，并且動作盡量輕柔，以減少因空氣流動揚起灰塵造成的污染；接種留下的污物，如用過的酒精棉、火柴梗等要及時清除，以免引起污染；并注意做好標記，以免弄混。

3 培養(yǎng)

待轉(zhuǎn)管完成，需要在潔凈的環(huán)境下，進行發(fā)菌培養(yǎng)，最好置于恒溫培養(yǎng)箱在適宜溫度培養(yǎng)，如常見的香菇菌種需要在24℃、靈芝（Ganoderma lucidum）、毛木耳 （Auricularia polytricha） 等在 30℃下培養(yǎng)。若培養(yǎng)環(huán)境含有雜菌較多，菌種感染雜菌的概率將增加，尤其是棉塞含雜菌孢子影響下，轉(zhuǎn)管的風險顯著提高。

3.1 溫度

培養(yǎng)溫度一般選擇25℃，特殊食用菌菌種在其適宜培菌溫度下進行，如草菇（Volvariella volvacea）需要在30℃～35℃、部分金針菇（Flammulina velutipes），菌株 18℃～20℃[4]。

3.2 培菌

按所需條件培養(yǎng)4 d～5 d，需查看試管菌種生長情況，挑揀出污染試管。之后每3天挑揀1次直至試管斜面長滿菌絲，一般香菇、黑木耳（Auricularia auricula）、灰樹花 （Grifola frondosa） 菌種 15 d～20 d、羊肚菌（Morchella esculenta） 菌種7 d～10 d就能長滿。

4 保藏

待菌絲長滿斜面后，應及時將試管斜面送0～4℃冰箱保藏，同時做好入庫記錄。冰箱宜采用溫度較為穩(wěn)定的4℃保藏冰箱。若冰箱有玻璃窗可看到內(nèi)部，需進行遮光處理，如可在冰箱玻璃上粘上遮光布。每隔3 d～4 d需查看冰箱溫度，看是否出現(xiàn)溫度異常，并做好巡查記錄，以便留檔。部分菌種需要特殊培養(yǎng)保藏溫度，如草菇保藏溫度為15℃，毛木耳部分菌株宜在8℃保藏[4]。

5 活化

經(jīng)過低溫保藏的食用菌菌種，不能直接進行轉(zhuǎn)管接種，否則會影響轉(zhuǎn)管成功率。菌種進行生產(chǎn)擴繁或者定期轉(zhuǎn)管前，需要將其置于該種菌株適宜生長溫度（15℃～20℃） 中活化培養(yǎng)12 h～24 h，再進行轉(zhuǎn)管接種。

6 結(jié)論

瓊脂斜面低溫保藏方法操作較為簡單，設備、環(huán)境等要求也不高，比較適宜中小菌種企業(yè)日常菌種保藏，但是由于其保藏時間短（需要每3個月～每4個月轉(zhuǎn)管1次），工作量比較大，轉(zhuǎn)管次數(shù)的增加會增加菌種退化風險，而且若是保藏較多菌株，容易增加人為混種風險，因此不太適合大批量菌種保藏和長期菌種保藏。建議中小食用菌菌種企業(yè)與大型種質(zhì)資源保藏中心合作，由保藏中心進行菌種的長期保藏，并定時回引菌株，進行生產(chǎn)擴繁，避免生產(chǎn)用菌株因長期瓊脂斜面低溫保藏造成錯種、退化等問題，引發(fā)菌種事故。