賀國強(qiáng)，魏金康，吳尚軍，胡曉艷，趙?？?，鄧德江

（北京市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，北京100029）

羊肚菌屬（Morchella） 是一類珍稀且美味的食（藥）用菌，羊肚菌的人工栽培受到全球廣泛關(guān)注。法國最早開展羊肚菌的馴化栽培研究[1-2]。1982年美國的Ron Ower等[3]首次獲得了室內(nèi)栽培的羊肚菌子實(shí)體，隨后美國進(jìn)行了數(shù)年的羊肚菌產(chǎn)業(yè)化工廠栽培，但均以失敗告終。上世紀(jì)80年代我國開始羊肚菌的相關(guān)研究，于90年代成功實(shí)現(xiàn)了人工栽培羊肚菌，并開創(chuàng)了羊肚菌大田栽培模式[4-6]，對(duì)于羊肚菌產(chǎn)業(yè)化具有重要意義。自2012年我國羊肚菌進(jìn)入了產(chǎn)業(yè)化時(shí)期以來，栽培由最初的2.0×106m2，迅速增長到了2016年的2.3×107m2[7]。

羊肚菌的品種選育對(duì)于栽培開發(fā)至關(guān)重要。目前已知羊肚菌屬有61個(gè)種，東亞或中國分布了該屬近一半的物種（30種），歐洲分布有23種，北美分布有19種[8]。根據(jù)形態(tài)學(xué)的特征如菌蓋近中部與菌柄是否分離、菌蓋邊緣是否明顯向外伸展、菌蓋的形狀和顏色、蓋表棱紋排列和凹坑的深淺等，羊肚菌屬被分為3個(gè)大類：黑色羊肚菌類、黃色羊肚菌類和半開羊肚菌類；但是基于LSU、ef1-α、rpb1和rpb2四個(gè)基因的核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)羊肚菌屬可劃分為黃色羊肚菌支系（Esculenta Clade）、黑色羊肚菌支系（Elata Clade） 和變紅羊肚菌支系（Rufobrunnea Clade）[9-11]。部分黑色種類的羊肚菌如梯紋羊肚菌（M.importuna）、六妹羊肚菌（M.sexte－lata）、七妹羊肚菌（M.septimelata）、尖頂羊肚菌（M.conica）、羊肚菌（M.esculenta） 已成功馴化栽培，其中商業(yè)化栽培主要以梯紋羊肚菌、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌為主[12-15]。

開展野生羊肚菌的采集和收集，積累了不少種質(zhì)資源，通過對(duì)羊肚菌菌株（羊CP）的菌絲生物學(xué)特性和子實(shí)體農(nóng)藝性狀進(jìn)行研究，馴化栽培優(yōu)質(zhì)資源，以期為商業(yè)開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

野生羊肚菌子實(shí)體于2014年采集自北京市昌平區(qū)延壽鎮(zhèn)黑山寨（北緯N40°21′11.99″， 東經(jīng)E116°17′47.68″）。經(jīng)組織分離獲得純培養(yǎng)菌絲體，菌株命名為羊CP，由北京市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站食用菌試驗(yàn)室保藏（館藏編號(hào)：BJAESF201401）。經(jīng)ITS序列鑒定，結(jié)合Blast在線比對(duì)（98%），結(jié)果表明菌株羊CP是歐氏羊肚菌 Morchella owneri X.H.Du，MycoBank登錄號(hào)為 MB828952[16]。

1.2 培養(yǎng)基

菌株的分離與保藏，采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基。菌絲最適培養(yǎng)條件研究，采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基和加富培養(yǎng)基[17]。

1.3 菌絲體培養(yǎng)條件

1.3.1 溫度試驗(yàn)

用已滅菌打孔器（直徑6 mm）均勻截取已活化的菌絲體塊，并接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃和30℃恒溫避光培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)7 d后觀察記錄。

1.3.2 pH試驗(yàn)

采用精密pH試紙，用10%氫氧化鈉和10%鹽酸在超凈工作臺(tái)中調(diào)節(jié)滅菌后的基礎(chǔ)培養(yǎng)基pH，調(diào)節(jié)后的培養(yǎng)基pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，每個(gè)pH設(shè)置3個(gè)重復(fù)，接種后25℃避光培養(yǎng)7 d，觀察記錄。

1.3.3 碳源試驗(yàn)

以基礎(chǔ)培養(yǎng)基中20 g葡萄糖的含碳量為標(biāo)準(zhǔn)，分別以相等含碳量的蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、乳糖代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，其他成分同基礎(chǔ)培養(yǎng)基。每個(gè)處理3次重復(fù)，接種后25℃避光培養(yǎng)7 d，觀察記錄。

1.3.4 氮源試驗(yàn)

以基礎(chǔ)培養(yǎng)基中2 g蛋白胨的含氮量為標(biāo)準(zhǔn)，分別以相等含氮量的酵母粉、氯化銨、硝酸銨、黃豆粉、麩皮代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨。其他成分同基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每個(gè)處理3次重復(fù)，接種后25℃避光培養(yǎng)7 d，觀察記錄。

1.3.5 菌絲日均生長速度測定

以同批試驗(yàn)中菌絲生長最快的菌落為標(biāo)準(zhǔn)，最快菌落的菌絲將近長滿90 mm平皿而未滿時(shí)作為測量終點(diǎn)，對(duì)其他菌落同時(shí)進(jìn)行測量。最后取3個(gè)測量數(shù)據(jù)的平均值。日均生長速度（V，cm·d-1）的計(jì)算公式為：

式中：R2為最后1次測量菌落半徑（cm）；R1為第1次測量菌落半徑（cm）；D為菌落培養(yǎng)天數(shù)（d）。

1.4 馴化和栽培

1.4.1 栽培種制作

按照木屑65%、小麥30%、腐殖土3%、石膏1%、白灰1%，含水量60%的配方拌料，分別裝入聚丙烯塑料袋（35.0 cm×16.5 cm）中，每袋裝濕料1.0 kg。每袋接入1塊原種菌種（大小1.0 cm×1.0 cm）。培養(yǎng)溫度20℃，空氣濕度60%，避光培養(yǎng)直至長滿菌包。

1.4.2 播種與發(fā)菌

播種前將土面澆濕，待水滲入土壤不粘手時(shí)開始播種。在土面上鋪撒滅菌后的基料。將羊肚菌栽培種從菌種瓶（袋）中挖出，揉碎成顆粒狀，均勻撒在土層表面，然后使用微型旋耕機(jī)將土面旋耕1次。菌種用量為 0.6 kg·m-2～0.9 kg·m-2。按南北方向做畦床，床寬1.0 m，高15 cm，畦間溝寬0.4 m。播種后10 d～15 d，待菌絲長滿畦面后開始產(chǎn)生分生孢子時(shí)，放置滅菌后的營養(yǎng)袋。營養(yǎng)袋內(nèi)培養(yǎng)料的配方為稻殼69%、小麥30%和石灰1%。將營養(yǎng)袋縱向的1個(gè)面用釘板打20個(gè)～30個(gè)孔，使打孔面貼近地面。每平方米用3袋營養(yǎng)袋（折幅×長度=15 cm×35 cm）。

1.4.3 出菇

當(dāng)羊肚菌發(fā)菌60 d后，畦面白色菌絲褪去，進(jìn)入出菇期。撤掉外援營養(yǎng)袋，調(diào)節(jié)土壤含水量20%和溫度10℃～12℃。羊肚菌分化原基后適當(dāng)增強(qiáng)光照，溫室內(nèi)溫度控制在15℃～20℃。保持空間環(huán)境的空氣相對(duì)濕度在75%～80%，將光照強(qiáng)度控制在600 lx～800 lx。每天通風(fēng)2次～4次，每次通風(fēng)時(shí)間維持在30 min左右，使二氧化碳濃度控制在1 964 mg·m-3以內(nèi)。出菇后，比較各品種羊肚菌子實(shí)體形態(tài)及栽培產(chǎn)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對(duì)菌絲體生長的影響

不同碳源對(duì)菌絲體生長的影響見圖1、表1。

表1 碳源對(duì)羊CP（Morchella owneri）菌絲體生長速度影響Tab.1 Effect of Carbon sources on growth speed of Morchella owneri mycelium

如圖1、表1所示，羊CP在不同碳源培養(yǎng)基中均能生長，但菌絲利用碳源能力不同，因而生長速率有差異。在不同碳源培養(yǎng)基上，羊CP菌絲生長速度最快為乳糖，其次為可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖，最慢的為麥芽糖。羊肚菌菌絲生長迅速，初期無色或淺白色，菌絲迅速長滿平板，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌絲逐漸濃密并轉(zhuǎn)為淺黃至黃褐色，并產(chǎn)生淺黃至棕黃色菌核。添加葡萄糖的培養(yǎng)基菌絲由白色最終變?yōu)闇\黃色；添加蔗糖和乳糖培養(yǎng)基的菌絲由白色最終變?yōu)辄S色；添加麥芽糖和可溶性淀粉培養(yǎng)基的菌絲由白色最終變?yōu)樽厣?。菌核產(chǎn)生量最大為葡萄糖、蔗糖，其次為可溶性淀粉、麥芽糖，最小的為乳糖。綜合菌絲生長速度和菌核長勢，羊CP菌絲生長最適的碳源為乳糖；產(chǎn)生菌核最適合的碳源為葡萄糖和蔗糖。

2.2 不同氮源對(duì)菌絲體生長的影響

不同氮源對(duì)菌絲體生長的影響見圖2、表2。

表2 氮源對(duì)羊CP（Morchella owneri）菌絲體生長速度的影響Tab.2 Effect of nitrogen sources on growth speed of Morchella owneri mycelium

如圖2、表2所示，羊CP在不同氮源培養(yǎng)基中均能生長。在不同氮源培養(yǎng)基上，羊CP菌絲生長速度最快為黃豆粉和蛋白胨，其次為酵母浸粉、硝酸銨、麩皮，最慢為氯化銨。羊肚菌菌絲生長迅速，初期無色或淺白色，菌絲迅速長滿平板，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌絲逐漸濃密并轉(zhuǎn)為淺黃色，并產(chǎn)生淺黃色菌核。添加蛋白胨和麩皮培養(yǎng)基的菌絲由白色最終變?yōu)闇\棕色；添加酵母粉培養(yǎng)基的菌絲由白色最終變?yōu)闇\黃色；添加黃豆粉培養(yǎng)基的菌絲由白色最終變?yōu)樽厣?；添加氯化銨和硝酸銨培養(yǎng)基的菌絲呈羽毛狀，不變色。菌核產(chǎn)生量最大為蛋白胨和黃豆粉，其次為酵母粉，最小為麩皮、硝酸銨、氯化銨。綜合菌絲生長速度和長勢，羊CP菌絲生長的最適合氮源為黃豆粉和蛋白胨，菌核產(chǎn)生的最適氮源為酵母粉。

2.3 不同溫度對(duì)菌絲體生長的影響

羊CP在不同溫度培養(yǎng)基生長情況見圖3、表3。

表3 不同溫度對(duì)羊CP（Morchella owneri）菌絲體生長速度影響Tab.3 Effect of different temperatures on growth speed of Morchella owneri mycelium

由圖3、表3可知，羊CP菌絲的生長溫度范圍為10℃～25℃，在5℃和30℃條件下均可萌發(fā)，但幾乎不生長。菌絲生長速率依次為25℃＞20℃＞15℃＞10℃＞30℃和5℃。在20℃～25℃，羊肚菌菌絲生長迅速，初期無色或淺白色，菌絲迅速長滿平板，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌絲逐漸濃密并轉(zhuǎn)色，并產(chǎn)生菌核。隨著培養(yǎng)溫度的增高，菌絲由淺黃色很快變?yōu)闇\棕色或棕色，表明老化速度加快。當(dāng)菌絲成熟時(shí)開始產(chǎn)生菌核，不同溫度條件下產(chǎn)生菌核的快慢和數(shù)量不同。菌核產(chǎn)生量依次為：25℃＞20℃＞15℃＞10℃。在5℃和30℃條件下，未產(chǎn)生菌核。綜合菌絲生長和菌核產(chǎn)生情況，羊CP菌絲生長和菌核產(chǎn)生的最適合溫度均為25℃。

2.4 不同pH對(duì)菌絲體生長的影響

羊CP在pH 4～pH 11均能生長，但菌絲在不同pH條件下生長情況差異較大，見圖4、表4。

表4 不同pH對(duì)羊CP（Morchella owneri）菌絲體生長速度影響Tab.4 Effect of different temperatures on growth speed of Morchella owneri mycelium

由圖4、表4可知，羊CP在不同pH培養(yǎng)基上菌絲生長速度最快為7.0和8.0，其次是6.0、9.0、10.0、11.0和5.0，最慢的為4.0。在不同pH條件下，羊肚菌菌絲生長迅速，初期無色或淺白色，菌絲迅速長滿平板，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌絲逐漸濃密并轉(zhuǎn)色，并產(chǎn)生菌核。隨著pH的增加，菌絲顏色加深，至8.0達(dá)到最深，然后變后變淺。當(dāng)pH為4.0、5.0、10.0、11.0時(shí)，菌絲變?yōu)闇\黃色；當(dāng)pH為7.0和9.0時(shí)，菌絲變?yōu)闇\棕色；當(dāng)pH為8.0時(shí)，菌絲變?yōu)樽厣＞水a(chǎn)生量最大的pH為7.0、8.0、9.0、6.0，其次是10.0和5.0，最小的為4.0。綜合菌絲生長速度和長勢，羊CP的最適pH為8.0。

2.5 羊CP與其他羊肚菌品種的栽培產(chǎn)量比較

在室溫20℃、濕度60%的室內(nèi)暗光培養(yǎng)條件下，栽培種20 d菌絲長滿菌包。在日光溫室內(nèi)播種后，菌絲7 d可穿透土層，長滿畦面。55 d～70 d，土面出現(xiàn)白色透明的圓斑狀原基，5 d～8 d后發(fā)育成幼菇，15 d～20 d原基長大，此時(shí)采收第一潮菇。采收的栽培子實(shí)體高5 cm～8 cm，菌蓋直徑1.5 cm～2.1 cm，馴化栽培的羊CP子實(shí)體見圖5，各品種羊肚菌菌株的子實(shí)體比較見圖6。

由圖6可知，相較其他栽培品種羊CP（子實(shí)體個(gè)頭較小，其原基發(fā)生數(shù)量多，菇體生長的密度較高，密度最大處0.2 m2成菇數(shù)量超過500個(gè)，其與其他羊肚菌品種的栽培產(chǎn)量比較見表5。

表5 羊CP（Morchella owneri）與其他羊肚菌品種的栽培產(chǎn)量比較Tab.5 Average yields between Morchella owneri and other Morchella spp.strains

根據(jù)表5測產(chǎn)統(tǒng)計(jì)，羊CP的平均產(chǎn)量為1.235 kg·m-2，僅次于新馴化的品種HM、T2；較目前大規(guī)模生產(chǎn)使用的羊1（平均產(chǎn)量為0.880 kg·m-2）和羊4（平均產(chǎn)量為1.150 kg·m-2），產(chǎn)量分別提高40.34%、7.40%。此外，羊CP子囊果更接近于野生羊肚菌，肉質(zhì)脆嫩，口感較好，具有一定開發(fā)價(jià)值。試驗(yàn)初步結(jié)果表明，羊CP具有在日光溫室內(nèi)栽培推廣的價(jià)值。

3 結(jié)論與討論

羊肚菌是一類具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值和科研價(jià)值的食（藥）用真菌。隨著商業(yè)化人工栽培技術(shù)的成功，羊肚菌栽培大面積推廣，因此近年來野生羊肚菌資源成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。

菌絲生長速度和長勢受到營養(yǎng)和生長環(huán)境的影響，是選擇優(yōu)質(zhì)菌株的重要指標(biāo)之一[18]。不同菌株在不同培養(yǎng)條件下生長特性差異往往很大。羊CP可以利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、可溶性淀粉等作為碳源，最適碳源為乳糖。前人的研究也表明，羊肚菌（M.impoauna） A1菌株的最適碳源為甘露醇、阿拉伯糖和乳糖[19]，二者相一致。但不同種羊肚菌的最適碳源并不相同。羊肚菌（M.esculenta）最適碳源為可溶性淀粉[20-21]；對(duì)于尖頂羊肚菌，合適的碳源是蔗糖、淀粉、麥芽糖和葡萄糖[22-23]。

羊CP最適氮源為蛋白胨和黃豆粉，最適氮源蛋白胨與前人報(bào)道一致[19]。羊肚菌對(duì)氮源的利用情況也因種類不同有所差異。羊肚菌（M.esculenta）最適氮源為尿素、蛋白胨或硝酸銨，且因菌株不同存在差異[20-21]；對(duì)于尖頂羊肚菌，最適氮源是天冬氨酸、半光氨酸和亞硝酸鈉[22]。

羊CP最適溫度為25℃，與前人的研究一致[19,21,24-25]，與陳芳草的研究不同[23]。羊CP最適 pH為8.0，與龔燕川的研究一致[26]。謝放等[21]報(bào)道即使是同一個(gè)種羊肚菌的不同菌株，最適pH也不相同。野生條件下，羊肚菌經(jīng)常發(fā)生于石灰性土壤和火燒地環(huán)境[27]。據(jù)此推測，羊肚菌菌絲生長最適pH多為近中性至偏堿性條件。

ITS鑒定是真菌分子鑒定的重要手段之一[28-29]。羊CP雖然經(jīng)過ITS鑒定為歐氏羊肚菌（M.owneri），屬于黑色羊肚菌系[16]，但其子實(shí)體形態(tài)特征與目前大規(guī)模栽培使用的梯棱羊肚菌存在差異。表現(xiàn)為子實(shí)體菌蓋為灰褐色、尖錐形，縱棱排列較規(guī)則，呈波浪狀彎曲，橫棱不明顯，凹坑稍淺，接近于野生羊肚菌的特征，表明羊CP有馴化為新栽培品種的可能。從栽培試驗(yàn)的鮮菇產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)看，羊CP相較于目前商業(yè)化栽培的梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌菌株的產(chǎn)量均有所提高。這也表明羊CP具備栽培推廣的價(jià)值，但其穩(wěn)產(chǎn)性和抗病性等特性需要進(jìn)一步進(jìn)行栽培試驗(yàn)。

綜上，通過對(duì)采集自北京的1株野生羊肚菌羊CP進(jìn)行菌絲培養(yǎng)條件研究和大田栽培試驗(yàn)，結(jié)果明確了其最適碳源、氮源、溫度和最適pH，可為進(jìn)一步研究馴化羊CP菌株提供參考。羊CP菌株栽培試驗(yàn)中，鮮菇產(chǎn)量達(dá)1.235 kg·m-2，子實(shí)體形態(tài)接近野生狀態(tài)，肉質(zhì)脆嫩，具有一定栽培推廣價(jià)值。