胡柳 韓銓 吳妍 王威 李棟

[摘要]目的 通過比較不同造模參數(shù)的綜合放血方法，確定血虛模型的最優(yōu)造模參數(shù)，為該方法的可重復標準化提供數(shù)據(jù)支持。方法 將100只ICR小鼠隨機分為5組：正常對照組（n=20）、模型組A（每日游泳15 min+隔日放血0.3 ml，n=20）、模型組B（每日游泳10 min+隔日放血0.3 ml，n=20），模型組C（每日游泳15 min+隔日放血0.5 ml，n=20）以及模型組D（每日游泳10 min+隔日放血0.5 ml，n=20），造模9 d后取胸腺、脾臟以及血液，測定5組小鼠的體重、免疫器官指數(shù)、死亡率、血常規(guī)指標、血清免疫因子白細胞介素-6（IL-6）水平及紅細胞膜Na+-K+-ATP酶活性。結果 模型組A、B、C、D小鼠造模9 d后的體重、免疫器官指數(shù)、血常規(guī)指標（紅細胞、白細胞、血紅蛋白和血小板）、血清IL-6水平和紅細胞膜Na+-K+-ATP酶活性均低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;模型組B小鼠造模9 d后的死亡率低于模型組A、C和D，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 每日游泳10 min+隔日放血0.3 ml為較優(yōu)的中醫(yī)血虛證候模型的造模參數(shù)。

[關鍵詞]綜合放血法;血虛證;中醫(yī)證候模型

[中圖分類號] R332? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2020）9（b）-0035-04

Comparative study of mouse model of blood deficiency pattern caused by comprehensive bloodletting

HU Liu? ?HAN Quan? ?WU Yan? ?WANG Wei? ?LI Dong

Zhejiang Yangshengtang Natural Medicine Research Institute Co. Ltd.， Zhejiang Province， Hangzhou? ?310024， China

[Abstract] Objective To compare the comprehensive bloodletting in different modeling parameters to determine the optimal one with blood deficiency pattern， and to provide data support for the repeatable standardization of the method. Methods A total of 100 ICR mice were randomly divided into 5 groups： normal control group （n=20）， model group A （15 min swimming daily+bloodletting 0.3 ml every other day， n=20）， model group B （10 min swimming daily+bloodletting 0.3 ml every other day， n=20）， model group C （15 min swimming daily+bloodletting 0.5 ml every other day， n=20） and model group D （10 min swimming daily+bloodletting 0.5 ml every other day， n=20）. Thymus， spleen and blood were collected for measuring the weight， immune organ index， blood routine indicators （including red blood cells， leukocytes， hemoglobin and platelets）， serum interleukin-6 （IL-6） levels and erythrocyte membrane Na+-K+-ATPase activity after nine days model establishment. Results The weight， immune organ index， blood routine indicators （including red blood cells， leukocytes， hemoglobin and platelets）， serum IL-6 levels and erythrocyte membrane Na+-K+-ATPase activity in the model group A， B， C， and D were lower than those in the normal control group after nine days model establishment， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The animal mortality rate of the model group B was lower than that of model group A， C， and D， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion Daily swimming for 10 min + bloodletting 0.3 ml every other day is the optimal model parameters for traditional Chinese medicine syndrome of blood deficiency pattern.

[Key words] Comprehensive bloodletting; Blood deficiency pattern; Traditional Chinese medicine syndrome model

血虛證是臨床常見的病癥，多數(shù)原因為失血過多、脾胃虛弱，或者血液生化之源不足以及瘀血阻滯等。目前國內研究人員造模采用較多的是慢性放血，使其“有形之血不能速生”，配合疲勞、饑餓等方式損傷其中焦脾胃，造成脾虛、氣虛，使血液生化之源匱乏而制作出接近臨床血虛證表現(xiàn)的小鼠動物模型，充分彌補了早期通過放化療損傷這個單一因素造模不能全面反映中醫(yī)血虛證候復雜的病理變化的缺陷。但該中醫(yī)證候動物模型沒有統(tǒng)一標準的造模參數(shù)，造成研究者重復實驗時需要重新摸索參數(shù)，浪費大量時間和精力。本研究通過對比力竭運動時間（游泳時間）及放血體積的不同參數(shù)對小鼠體重、免疫器官指數(shù)、死亡率、血常規(guī)指標、血清白細胞介素-6（IL-6）水平及紅細胞膜Na+-K+-ATP酶活性的影響，確定血虛證的最優(yōu)造模參數(shù)，現(xiàn)報道如下。

1實驗材料與方法

1.1實驗動物及分組

實驗用ICR小鼠[上海斯萊克實驗動物有限責任公司;生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005]100只，雄性，6周齡，體重（25±1）g，于浙江省醫(yī)學科學院動物實驗中心飼養(yǎng)，室內溫度（22±2）℃，相對濕度30%～40%，各組小鼠喂食常規(guī)飼料，自由飲水。ICR小鼠經適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組與4個不同參數(shù)模型組（模型組A、B、C、D），每組各20只。實驗在浙江省醫(yī)學科學院動物醫(yī)學倫理委員會批準下進行。

1.2試劑及儀器

ATP酶試劑盒（南京建成生物工程研究所）;IL-6 Elisa試劑盒（美國R&D公司）;庫爾特細胞全自動分析儀（美國Becman公司）。

1.3造模方法

小鼠適應性飼養(yǎng)后，每日模型組4組小鼠置于自制塑料盒（50 cm×120 cm×40 cm）中強迫游泳10 min或15 min，水溫20℃，隔日眼眥取血0.3 ml或0.5 ml，實驗期間飼料控制在每日75 g/kg，連續(xù)9 d，制成血虛證模型。其中模型組A（n=20）：15 min游泳+0.3 ml放血;模型組B（n=20）：10 min游泳+0.3 ml放血;模型組C（n=20）：15 min游泳+0.5 ml放血;模型組D（n=20）：10 min游泳+0.5 ml放血。

1.4取材及檢測

于造模后第10天，對各組小鼠進行股動脈取血，除了抗凝全血外，1500 r/min離心10 min，取得血清做生化測定，處死動物后取胸腺和脾臟稱重。

取抗凝全血加入血細胞分析儀中上機直接進行血常規(guī)分析，主要測定紅細胞、白細胞、血小板以及血紅蛋白數(shù)量。

將肝素鈉抗凝全血4℃離心（1500 r/min，10 min），吸去上清液并小心吸去壓積紅細胞上層的白色絨毛狀膜成分。將壓積紅細胞用10倍體積的4℃生理鹽水懸浮，4℃離心（1500 r/min，10 min），重復2～3次。直到上清液無色，吸去上清液，保留壓積紅細胞。取壓積紅細胞按1∶10比例加入去離子水，混勻混合。4℃放置20 min，由于出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，液體由鮮紅色變?yōu)橥该靼导t色。4℃平衡離心（12 000 r/min，30 min），吸去暗紅上清液，可見底部一塊粉紅色沉淀，重復3次，直到沉淀部分呈乳白色，棄去上清液及離心管底部褐色的纖維蛋白樣沉淀斑，收集白色或淺粉色血影膜。將血影膜懸浮于一定體積的去離子水中，混合均勻，用考馬斯亮藍法測定蛋白含量。規(guī)定每小時每107個紅細胞的Na+-K+-ATP酶分解三磷酸腺苷（ATP）產生1 μmol無機磷的量為一個Na+-K+-ATP酶活性單位，即μmol Pi/（107個紅細胞·h）。按ATP酶試劑盒說明書測定紅細胞膜Na+-K+-ATP酶活性。

1.5統(tǒng)計學方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布計量資料的均數(shù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，不符合正態(tài)分布者經過變量轉換為正態(tài)分布后行統(tǒng)計學分析;計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，以P<0.01為統(tǒng)計學差異極顯著。

2結果

2.1各組小鼠的一般狀況

外觀變化可以清楚地反映小鼠的進食、飲水、飼養(yǎng)等情況。在實驗造模期間內，模型組A、B、C、D的小鼠外觀均發(fā)生了比較明顯的變化，如耳廓鼻唇顏色變淺、皮毛不光澤、精神萎靡、腰背團縮、動作靈敏度降低等。

2.2各組小鼠體重、免疫器官指數(shù)和死亡率的比較

模型組A、B、C、D小鼠的初始體重與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。模型組A、B、C、D小鼠造模9 d后的體重均低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。模型組A、B、C、D小鼠造模9 d后的體重比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。模型組A、B、C、D小鼠的免疫器官指數(shù)（胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)）均低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。模型組A、B、C、D小鼠造模9 d后的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。模型組A、C和D小鼠造模9 d后死亡率高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。模型組B小鼠造模9 d后死亡率與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。模型組B小鼠造模9 d后死亡率低于模型組A、C和D，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表1）。

2.3各組小鼠血常規(guī)指標的比較

模型組A、B、C、D小鼠造模9 d后的紅細胞、白細胞、血紅蛋白以及血小板計數(shù)均低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。模型組A、B、C、D小鼠造模9 d后的血常規(guī)指標比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（表2）。

2.4各組小鼠血清IL-6水平和紅細胞膜Na+-K+-ATP酶活性的比較

模型組A、B、C、D小鼠造模9 d后的血清IL-6水平和紅細胞膜Na+-K+-ATP酶活性均低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。模型組A、B、C、D小鼠造模9 d后的血清IL-6水平和紅細胞膜Na+-K+-ATP酶活性比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（表3）。

3討論

中醫(yī)認為肝藏血，具有貯藏血液、調節(jié)血量及防止出血的功能;脾統(tǒng)血，具有統(tǒng)攝、控制血液在脈中平穩(wěn)運行，防止血液溢出脈外的功能，如《金匱要略》所述“五臟六肺之血，全賴脾氣統(tǒng)攝?！笔а獣鸶闻K萎縮，藏血功能失常;脾臟萎縮，統(tǒng)攝血液功能失常;胸腺萎縮，免疫功能低下，從而表現(xiàn)為血虛的證候。血虛證動物模型研究目前有失血性（綜合失血法）、化學損傷[1-2]、放射性損傷[3-4]和免疫介導[5-6]4類模型。通過中醫(yī)學的定義和古籍文獻的描述可知，血虛多由失血、勞倦、飲食不足等原因引起，故本研究采用綜合放血法（力竭游泳+放血+限食），符合血虛證中醫(yī)證候的病因。經過每日觀察記錄發(fā)現(xiàn)模型組小鼠在造模后的第3天即出現(xiàn)行動遲緩，團縮弓背，面、眼、耳、尾蒼白而涼，毛蓬豎而少光澤，血色暗紅，大便稀等典型血虛癥狀。

通過整理文獻報道的綜合放血法致血虛模型，發(fā)現(xiàn)造模參數(shù)差異較大，有每日強迫力竭游泳20 min+隔日放血0.3 ml[7]、也有隔日游泳20 min+隔日放血0.4 ml[8-10]、隔日游泳20 min+隔日放血0.3 ml以及每日游泳2次（時長不定）+隔日放血0.5 ml等，對新的研究者的參考意義并不大。本研究通過設置不同的力竭游泳時間和放血量，考察體重、免疫器官指數(shù)、死亡率、血常規(guī)指標、血清IL-6水平及紅細胞膜Na+-K+-ATP酶活性對比血虛模型的造模程度，結果顯示，模型組A、B、C、D小鼠造模9 d后的體重及免疫器官指數(shù)均低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。紅細胞為運送氧氣的主要媒介且具有免疫功能，血紅蛋白含量高低代表著血虛程度的輕重，白細胞為免疫細胞，具有吞噬異物產生抗體的作用，而血小板在造血過程中也發(fā)揮重要作用。本研究結果顯示，模型組A、B、C、D小鼠造模9 d后的紅細胞、白細胞、血紅蛋白以及血小板含量均低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明血虛小鼠的紅細胞運輸功能受到損傷，機體免疫水平低下，與其他研究者的結論較為一致[11-13]，并且隨著造模參數(shù)的變化，造模嚴重程度也加重。免疫細胞因子IL-6可誘導活化后的B細胞對免疫球蛋白（Ig）的分泌，同時促進T細胞的活化增殖、分化，尚能與IL-3協(xié)同誘導多種造血前體細胞的增殖，而興奮體液免疫系統(tǒng)，同時對細胞免疫和造血功能也有促進作用。本研究結果顯示，模型組A、B、C、D小鼠造模9 d后的血清IL-6水平低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與免疫器官指數(shù)、白細胞水平降低均一致，說明血虛證小鼠具有免疫力低下的狀況[14]，與其他研究者的結論一致[5]。紅細胞膜結構和功能的完整是紅細胞發(fā)揮作用的重要保證，而紅細胞的功能主要是通過膜蛋白來實現(xiàn)的，細胞膜上的Na+-K+-ATP酶保持膜內高鉀，膜外高鈉的平衡，能將ATP分解為二磷酸腺苷（ADP）并產生能量，對維持紅細胞的形態(tài)和功能具有重要作用，但在血虛狀態(tài)下其活力明顯降低。本研究結果顯示，模型組A、B、C、D小鼠造模9 d后Na+-K+-ATP酶活性低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與其他研究者的結論一致[15-20]。4種造模參數(shù)下都能夠成功制作出血虛模型，且4個模型的評估指標無顯著差異。本研究結果顯示，模型組A、C和D小鼠造模9 d后的死亡率高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示造模過嚴重會導致模型小鼠死亡率的大幅度增加。小鼠的死亡原因均為當晚被同籠相對較強的小鼠咬死并食用，因此模型組A、C和D無法達到每日限食75 g/kg的精確實驗條件，為實現(xiàn)造模方法的標準化且具有可重復性，在4組模型都造模成功的基礎上，優(yōu)先考慮模型組B的造模參數(shù)，即每日強迫力竭游泳10 min+隔日放血0.3 ml。

目前對于中醫(yī)證候模型血虛證判定成模的標準基本都以現(xiàn)代醫(yī)學的客觀指標為基礎，并根據(jù)陽性結果來判定，但對于這些客觀指標的特異性和權重并沒有深入研究，只有確定權重系數(shù)和量化指標的重要性，才能使得中醫(yī)證候模型更切合臨床實際情況和更具有可重復性，可在下一步研究中深入探討。

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（收稿日期：2019-07-25）