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        病理免疫組織化學抗原修復技術(shù)的研究

        2020-11-06 05:42:30崔錦珠文亦磊覃紹勇陳玲
        中國醫(yī)學創(chuàng)新 2020年24期
        關(guān)鍵詞:病理診斷免疫組織化學質(zhì)量控制

        崔錦珠 文亦磊 覃紹勇 陳玲

        【摘要】 20世紀70年代免疫組織化學技術(shù)開始應(yīng)用于病理診斷,發(fā)展到今天,免疫組織化學檢測在臨床病理診斷中已成為重要的技術(shù)手段,尤其在疑難病例的病理診斷和鑒別診斷工作中發(fā)揮著極為重要的作用。但為了確保免疫組化技術(shù)操作結(jié)果的準確性,必須實行可靠的質(zhì)量控制和標準化的操作。全自動免疫組織化學染色機的使用有利于規(guī)范化操作,使流程更加標準化,解決了部分問題,但在抗原修復環(huán)節(jié)仍有許多不同意見,該文就免疫組化技術(shù)操作環(huán)節(jié)中的抗原修復標準化進行綜述。

        【關(guān)鍵詞】 免疫組織化學 病理診斷 質(zhì)量控制

        [Abstract] In the 1970s, immunohistochemistry technology began to be used in pathological diagnosis. Today, immunohistochemistry detection has become an important technical means in clinical pathological diagnosis, especially in the pathological diagnosis and differential diagnosis of difficult cases. However, in order to ensure the accuracy of immunohistochemistry results, reliable quality control and standardized operation must be carried out. The use of automatic immunohistochemical staining machine is beneficial to standardize the operation, make the process more standardized, and solve some problems. However, there are still many different opinions in the antigen repair process. This paper summarized the standardization of antigen repair in the operation process of immunohistochemistry technology as follows.

        [Key words] Immunohistochemistry Pathological diagnosis Quality control

        First-authors address: The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, China

        doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2020.24.041

        醫(yī)療衛(wèi)生技術(shù)不斷進步,免疫組化技術(shù)也飛速發(fā)展,當今,在臨床病理診斷中免疫組化技術(shù)的大量運用,顯著提高了我國的病理診斷水平,免疫組化技術(shù)的地位也越來越高[1]。在腫瘤個性化治療的今天,依靠免疫組化技術(shù)進行精確診斷在日常病理診斷工作中占著非常大的比重,如雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人類表皮生長因子受體-2(HER2)的表達可為乳腺癌治療方案的選擇提供依據(jù);CD117(+)的胃腸道間質(zhì)瘤可選用格列寧藥物進行治療等。高質(zhì)量、穩(wěn)定、可重復性是免疫組織化學技術(shù)操作的關(guān)鍵,這就涉及一個名詞-標準化。首先提出免疫組化標準化這一概念的機構(gòu)是美國的國家臨床實驗標準委員會(national committee for clinical laboratory standards,NCCLS),它在1999年將這一標準統(tǒng)一到全球,發(fā)布了參考文件。免疫組化標準化概念的主題思想主要是:標準化的免疫組化染色技術(shù)(采用良好的組織前處理;良好的抗原修復技術(shù),使抗原充分暴露;可靠穩(wěn)定的標準化實驗操作過程);實驗對照的正確設(shè)立;染色結(jié)果的正確判讀;標準化的免疫組化檢測報告[2]。近些年許多病理學者也對其進行了討論和補充。現(xiàn)在大量全自動免疫組織化學染色機的使用有利于規(guī)范化操作,使流程更加標準化,解決了免疫組化染色技術(shù)的部分問題。但在抗原修復技術(shù)方面仍有很多不同意見,需要不斷完善、規(guī)范日常的技術(shù)流程。

        1 概述

        免疫組化的大多數(shù)標本是用4%中性甲醛固定,甲醛固定的標本會導致蛋白之間的交聯(lián)及抗原決定簇被封閉。自從Shi等[3]在1991年提出抗原熱修復方法后,大家知道通過不同的抗原修復方法,可暴露抗原決定簇,使抗原抗體結(jié)合。但不恰當?shù)男迯头椒稍斐蓛?nèi)源性生物素的表達,導致假陽性結(jié)果[4];或可造成抗原修復不成功,抗原暴露不充分,染色結(jié)果出現(xiàn)假陰性。只有掌握抗原最佳的修復方法才能提高免疫組織化學結(jié)果的陽性率與準確率。

        2 具體因素

        修復所涉及的因素主要有修復的方法、修復液的選擇、修復的時間等。目前各國實驗室主要采用蛋白酶消化法和熱處理方法來對抗原進行修復。熱處理方法又有微波加熱修復法、高壓加熱法和水浴法。而抗原修復液分為EDTA修復液(pH值8.0~9.0)、檸檬酸鹽修復液(pH值6.0)、Tris修復液(pH值10.0)等。各實驗室目前不僅采用不同的修復方法、不同的修復液,修復的時間也不盡相同。

        2.1 修復的方法 根據(jù)相關(guān)報道,包含英國、澳大利亞、加拿大等大國在內(nèi)的8個英聯(lián)邦國家組織了106家實驗室進行一項研究,總共花費接近3年的時間來對ER、PR進行反饋實驗。得出了一致結(jié)論:ER、PR染色弱的原因主要與實驗中微波加熱時間不足和微波操作過程不當有關(guān),因此免疫組化修復應(yīng)使用高溫高壓修復方法[2]。

        華裔實驗人員也通過收集上百份乳腺浸潤性導管癌標本論證該修復方法[5]。實驗人員對這些標本進行ER、PR、E-Cadherin、C-erbB-2四項免疫組織化學標記,使用顯微鏡觀察判斷這些標本的陽性率和陽性程度,證實了高溫高壓抗原修復法在標本的顯色強度和背景清晰度方面均高于傳統(tǒng)的微波修復法。

        也有學者分析了修復液、時間、pH值都相同的條件下,微波抗原修復法修復效果低的原因可能是:微波爐修復溫度不好控制,穩(wěn)定性差,切片就會出現(xiàn)一些非特異性染色。高壓修復則能很好地控制溫度,在120 ℃左右,能徹底消滅標本內(nèi)的生物酶活性,有效阻斷非特異性著色[6]。

        鄭秋樺等[7]也采用了控制變量法,使用改良Tris-EDTA(pH值9.0)修復液,通過微波、水煮和高壓幾種不同修復方法對P53、P63、Ki67、CK5/6、CK7幾個不同抗體進行免疫效果實驗,發(fā)現(xiàn)高壓修復方法的效果最好。何丹等[8]在食管癌標本用高壓抗原修復法和微波抗原修復法兩種方案進行CD4、CD8、IL17、Ki67等免疫組化染色實驗,最終實驗結(jié)果:CD4抗體表達實驗高壓修復效果優(yōu)于微波修復效果(P<0.05),其他三項指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),同時也提出高壓修復相對劇烈,容易引起掉片現(xiàn)象,應(yīng)該引起注意。

        在實驗室免疫組化檢測中,腦組織標本會出現(xiàn)掉片和背景染色等現(xiàn)象,會給明確診斷帶來嚴重影響。腦組織的構(gòu)成元素主要為膠質(zhì)細胞,通過神經(jīng)元連接而成,腦組織細胞中水分和脂質(zhì)含量較高,在修復過程中會發(fā)生掉片。針對這一現(xiàn)象,陳余朋等[9]認為可以將切片架外圍包裹一層紗布,紗布可以有效地將沸騰的修復液與組織隔離,防止沸騰沖擊導致的組織掉片和破損,在熱孵育法也可如此操作。

        在病理診斷中淋巴瘤分類有百余種,單借助HE染色結(jié)果很難有效進行診斷和鑒別診斷。最新NCCN指南要求,淋巴瘤診斷必須以形態(tài)學為基礎(chǔ),結(jié)合免疫組化方能確診。實驗組人員虞飛等[10]運用了各種修復手法,包括Tris-EDTA高壓修復法、Tris-EDTA煮沸修復法、檸檬酸高壓修復法、檸檬酸煮沸修復法、蛋白酶修復法、DAKO全自動染色機、LUMATAS全自動染色機、VENTANA全自動染色機等8種不同的修復方法對輔助淋巴瘤診斷的抗體CD5、CD10、CD23和Bcl-6進行免疫組化檢測,實驗結(jié)果證實高壓修復的免疫組化染色陽性結(jié)果強度最高,經(jīng)蛋白酶修復的免疫組化染色陽性強度最低。Tris(pH值9.0)高壓修復2.2 min能最有效地暴露抗原,是淋巴瘤標本中抗原修復的最佳方法,可為準確診斷淋巴瘤提供幫助。

        在高壓熱修復操作過程中,大家會注意到,單高壓熱修復也分為直接水煮、隔水加蓋水煮、隔水不加蓋水煮等方式。王璐[11]進行不同方式水煮加熱EDTA抗原熱修復實驗后認為,直接水煮抗原修復染色結(jié)果最好,隔水加蓋抗原修復次之,隔水不加蓋抗原修復最差。

        在熱孵育法中蔡俊杰[12]認為,甲醛固定的組織修復溫度必須達到92 ℃才能使抗原充分暴露,溫度范圍為92~98 ℃,95 ℃時效果最好。

        但對于不同抗原,修復所需溫度并不都遵守這一規(guī)律。鄒瓊瑜等[13]選取了保存時間超過4年的陳舊乳腺癌患者組織石蠟樣本76例。每個樣本選擇3張切片分別歸入試驗組、高壓組和微波組進行實驗。高壓組和微波組使用同種加熱修復方式處理切片,實驗組在酸堿度為(3.5±0.1)的檸檬酸鹽修復液中室溫修復15 min。對3組切片進行比較,可以看出實驗組的染色結(jié)果明顯優(yōu)于高壓組和微波組,脫片率及折損率也明顯低于高壓組和微波組?;さ臉?gòu)建和穩(wěn)定性主要由層黏連蛋白(laminin,LN)決定,它是基膜的主要構(gòu)成成分,并且這種糖蛋白在多種組織中都大量存在,使基膜與細胞緊密結(jié)合,對細胞的增殖分化有著較大的影響。劉鮮艷等[14]實驗人員分別使用高壓、胰酶、胃酶和聯(lián)合修復方式對LN進行修復測試,觀察修復方法的優(yōu)劣,得出胃酶1 h修復方式效果最好,LN染色結(jié)果最佳。

        有些組織并不需要抗原修復,而有些特殊組織不僅需要多重抗原修復方法聯(lián)合應(yīng)用,更需要延長一抗孵育時間,才能得到較好的實驗結(jié)果。

        黃建平等[15]用不同抗原修復法對HBcAg進行免疫組化染色,證實:切片不修復表達效果最好,切片高溫高壓修復,陽性表達最差。對于這個實驗結(jié)果,筆者認為乙肝病毒的核殼結(jié)構(gòu)蛋白HBcAg,結(jié)構(gòu)成分不是人體組織,固定時并不被甲醛封閉。加熱抗原修復,是修復甲醛固定抗原被封閉的組織,如果抗原未被甲醛固定封閉,高溫會使蛋白質(zhì)抗原發(fā)生變性,失去與抗體結(jié)合的能力,結(jié)果會使表達減弱甚至不表達。大多數(shù)抗原一般提倡的熱修復法,對于如HBcAg的特殊抗原會起反作用。馬秀利等[16]用不同修復方法對大鼠嗅黏膜低親和力p75NTR進行免疫組化比較時,認為神經(jīng)營養(yǎng)因子受體是低親和力受體,暴露其抗原決定簇的條件較高,應(yīng)當在酶修復(30 min)破壞福爾馬林對嗅黏膜上蛋白交聯(lián)作用后,再使用高溫修復使抗原暴露,另外延長一抗孵育時間至72 h可以得到較好的陽性結(jié)果。黃利等[17]也探討了抗原修復是否為單克隆抗體免疫組化染色的必須處理方式,筆者使用全自動免疫化染色機,分別進行p-stat3、Vimentin免疫組化抗原修復、不修復及陰性對照染色并對染色做出評價。從最終實驗結(jié)果可以明顯看出修復后的p-stat3和未修復未見明顯差異,而Vimentin免疫組化染色則需進行抗原修復處理。因此得出結(jié)論:抗原修復過程非常重要,但需要選擇性使用,有些抗體并不需要修復也能達成相同效果。

        由這些實驗數(shù)據(jù)可知,相同的修復液,高溫高壓法相對于熱孵育法、微波法、蛋白酶修復法有更好的修復能力。使用高溫高壓的修復處理方式能提高大多數(shù)免疫組化染色效果,使陽性定位準確,色彩鮮明。且切片直接接觸抗原修復液的修復方法染色結(jié)果最好。但是不存在適合所有抗原的單純抗原修復方法,要根據(jù)抗原的不同采用相應(yīng)的修復手段,即高溫高壓修復法也應(yīng)根據(jù)工作需要,合理選擇。

        2.2 修復液的選擇 抗原修復液的種類有很多,其中包括檸檬酸鹽修復液(pH值6.0)、EDTA修復液(pH值8.0~9.0)、EGTA修復液(pH值9.0)和Tris修復液(pH值10.0)。在抗原加熱修復過程中,抗原在不同酸堿度條件下等電點會發(fā)生變化,抗原表面電荷的改變影響抗原抗體的結(jié)合,從而影響染色強度[18]。

        Shi等[3]報道了不同pH值抗原脫蠟修復液對免疫組化抗原熱修復的影響,并認為pH值8~9的Tris-HCL或EDTA緩沖液適用于大多數(shù)抗原。張麗娜等[19]分別在pH值6.0和pH值9.0酸堿度下,觀察并檢測PD-L2分子作用于食管鱗狀細胞癌組織中的染色情況,得出結(jié)論:酸堿度為9.0的抗原修復液作用于食管鱗狀細胞癌,免疫組化染色情況最好,能明顯提高切片的染色質(zhì)量,是檢測PD-L2分子的最好方法。陳晨等[6]證實EDTA(pH值9.0)修復方式能夠提高快速冷凍乳腺癌組織ER、PR、HER2陽性表達率。李丹等[20]也證實相比于EDTA緩沖液,檸檬酸緩沖液的效果更好,能提高彌漫大B細胞淋巴瘤中的Ki67、BCL-2抗體表達。Tris-EDTA(pH值8.0)的修復液更有利于免疫組化染色過程中核抗原的暴露。

        江齊昌等[21]則以家兔作為實驗對象,對家兔的頸動脈粥樣硬化陳舊性蠟塊組織進行切片,共切片198張,使用單純加熱方式、單純胰蛋白酶和聯(lián)合抗原修復方式觀察切片中的染色結(jié)果。實驗最終得出結(jié)論:聯(lián)合抗原修復方式效果明顯優(yōu)于單純加熱方式或單純胰蛋白酶抗原修復方式,切片的染色效果更好。

        江桂英等[22]在實驗中使用了兩種不同的抗原修復液,微波加熱使用EDTA(pH值8.0)修復液和微波加熱使用檸檬酸鹽修復液(pH值6.0),結(jié)直腸癌組織Ki67、P53、CK20、CerbB-2、Bcl-2免疫組化染色實驗的對比結(jié)果:微波加熱使用EDTA(pH值8.0)修復液對于Ki67、P53、BCL-2修復效果更理想,但對于CK20,兩種修復液效果差別不大,微波加熱使用檸檬酸鹽修復液(pH值6.0)對C-erbB-2修復效果較好,但修復液pH值超過8.0時會影響組織的附著,容易掉片。

        綜上,大多數(shù)抗原更適合高溫高壓修復方式,而 pH值9.0修復液修復效果優(yōu)于pH值8.0的修復液。皮膚組織、雌激素受體、淋巴組織等選擇EDTA(pH值8.0),染色效果最佳[23]。

        2.3 修復過程對免疫組化染色結(jié)果的影響 通過以上幾組實驗論證,可以得知在免疫組化修復手段中,高溫高壓修復方法在大多數(shù)情況是最好的方法,但修復時間的把控也非常重要,過長的修復時間可能會導致細胞非特異性著色和組織脫片。

        黃建平等[24]探討了不同修復時間,檸檬酸抗原修復液對免疫組化染色結(jié)果的影響,噴氣后高壓加熱2、8及15 min三組切片,染色結(jié)果基本一致,27種抗體均表達良好,陽性定位準確,背景清晰。三組切片的陰性對照也均呈陰性,無背景染色。結(jié)果證實延長檸檬酸高壓修復時間并不會對染色結(jié)果造成實質(zhì)影響,修復時間過長不會暴露更多抗原決定簇,造成染色結(jié)果增強,甚至背景染色,也未造成抗原的破壞而減弱抗體表達。

        陳蕓等[25]收集47例乳腺癌及結(jié)直腸癌手術(shù)切除標本,并從標本中提取出腫瘤成分制作成結(jié)直腸癌及乳腺癌組織的芯片,按說明書建議進行熱修復。在修復過程中對芯片采取不同的降溫手段,一組使用自然降溫手段,自然冷卻20 min,另一組修復后立即用流水沖淋高壓鍋,或在鍋內(nèi)注水急劇降溫,降溫完成后對芯片進行觀察,發(fā)現(xiàn)芯片中ER、PR等幾組抗體的染色強度沒有明顯變化,但急速降溫組的Ki67表達弱于緩慢降溫組。結(jié)腸癌組織芯片中CK(CAM5.2)、CK(AE1/AE3)兩組染色強度差異不顯著,但CDX-2、Villin、MSH2急速降溫組的表達強度弱于緩慢降溫組。實驗表明,相比于急速降溫手段,自然降溫方法對芯片的修復效果更顯著,掉片率更低。因此在降溫過程中,最好關(guān)閉加熱裝置,等組織恢復自然溫度再進行后續(xù)的免疫組織操作。

        在臨床實踐中已經(jīng)證實免疫組化抗原修復時間對那些假陰性及弱陽性表達的組織有絕對性的影響,適當增加修復時間有利于提高組織切片的陽性結(jié)果。所以在免疫組化操作抗原修復環(huán)節(jié),抗原修復液的pH值、修復的溫度、修復的時間均會影響抗原修復。根據(jù)實驗表明,溫度越高,修復的時間也就越短[5]。

        3 展望

        免疫組織化學技術(shù)是現(xiàn)代醫(yī)學中一門重要的技術(shù),高質(zhì)量的免疫組織化學染色結(jié)果能輔助病理醫(yī)師更準確地進行病理診斷,提高病理診斷水平;非特異性的免疫組化染色結(jié)果可能會引起漏診甚至造成錯誤的病理診斷。所以提高免疫組織化學的制片質(zhì)量已經(jīng)是刻不容緩的責任。該技術(shù)的操作過程十分復雜,操作過程中的每一個環(huán)節(jié)都嚴重影響著切片的質(zhì)量。而選擇合適的免疫組化修復方法及掌握合適的修復液pH值及修復時間至關(guān)重要。臨床診斷要依據(jù)陽性的準確定位、內(nèi)外對照的結(jié)果、組織細胞形態(tài)學的觀察和豐富經(jīng)驗綜合判斷免疫組化結(jié)果。在工作中認真負責完成每一個環(huán)節(jié)是醫(yī)生和技術(shù)人員的責任,應(yīng)不斷學習,總結(jié)相關(guān)的操作經(jīng)驗,將切片操作過程現(xiàn)代化、規(guī)范化,并在操作過程中嚴格遵守實驗室的各種規(guī)章制度,充分發(fā)揮免疫組化技術(shù)在病理診斷中的重要作用,為醫(yī)院的臨床治療提供指導作用。在抗體使用說明書的指導下,結(jié)合自身實驗室的具體情況,根據(jù)抗體種類予以選擇修復,要清楚影響抗原的因素及各種抗原修復方法,必要時可以多種方法同時使用。

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        (收稿日期:2020-03-20) (本文編輯:程旭然)

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