王 霞， 歐陽艷艷， 王 晶， 王尚君， 董蓮華

(1.中國計量科學研究院，北京 100029；2.南京市計量監(jiān)督檢測院，江蘇 南京 210049)

1 引 言

基因測序技術和產業(yè)始于1990年啟動的人類基因組計劃[1]，是被全球生物科技界公認的對人類健康事業(yè)影響深遠的基礎性技術和效益外溢性極強的產業(yè)?；蛐蛄袦y量的準確性直接關系到人們對于生命活動的判斷，例如癌癥診斷[2～4]、無創(chuàng)產前診斷[5]等。高通量測序技術(high-throughput sequencing)又稱下一代測序技術(next generation sequencing technology, NGS technology)，以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標志[6]，使得對一個物種的基因組深度測序變得方便易行。

目前市場主流NGS測序儀包括Illumina和Life Technologies公司的測序平臺[7,8]，這2大測序平臺文庫的定量分析和質量評價對于獲得高質量的核酸測序數(shù)據(jù)十分關鍵。如果過高的估計測序文庫拷貝數(shù)，將不能獲得足夠的測序數(shù)據(jù)，導致降低數(shù)據(jù)產出；如果過低的估計測序文庫拷貝數(shù)，將產生低質量的測序數(shù)據(jù)，甚至會導致測序失敗。因此，要控制NGS測序文庫的載入量，保證測序數(shù)據(jù)的質量，就需要在測序前對DNA測序文庫進行定量質量控制。此外，為減少NGS運行成本，往往需要將不同測序文庫等摩爾量合并為一份測序樣品同時測序，這也以測序文庫的準確定量分析為前提，這樣才能保證不同文庫的測序數(shù)據(jù)的可靠性。

因此本研究以主流的Illumina高通量平臺為對象，開展DNA文庫定量質量控制技術研究，建立了DNA文庫絕對定量數(shù)字PCR方法，可用于DNA文庫定量標準物質的定值。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

大腸桿菌DH5為中國計量科學研究院保存；5個水平的文庫定量標準物質由中國計量科學研究院研制；SYBR熒光染料試劑盒購置于江蘇康為世紀生物科技有限公司；數(shù)字PCR芯片和GE loading試劑購自美國Fluidigm公司；EvaGreen mastermix購自美國伯樂公司。

2.2 方法

2.2.1 熒光定量PCR

采用Roche480熒光定量PCR儀，分別測定KAPA公司和Qiagen公司的定量標準品。PCR擴增體系20 μL：2×SYBR PCR mastermix 10 μL，雙向引物(濃度為10 μmol/L)0.4 μL，DNA模板4 μL，ddH2O 5.6 μL。PCR反應程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s， 60 ℃ 40 s，45 cycles。熔解曲線：95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min， 95 ℃連續(xù)采集信號。

2.2.2 數(shù)字PCR方法

采用數(shù)字PCR方法測定文庫定量標準物質的拷貝數(shù)濃度，再通過式(1)換算成摩爾濃度。按照下述步驟進行芯片數(shù)字PCR反應液的配制。

(1)

式中：cmol為摩爾濃度，pmol/L；ccopy為拷貝數(shù)濃度，copy/L；NA為阿伏加德羅常數(shù)。

芯片數(shù)字PCR(cdPCR)方法的實驗操作步驟[9]：首先對12×765芯片標記A1的一端孔內加入1 mL的礦物油，然后將芯片放入加樣器(IFC controller)，點擊“prime”對芯片進行prime。待prime完成后，首先在12×765芯片樣品孔的兩端孔內加入10 μL的無DNA水；然后將配制好的含有DNA模板的PCR反應液10 μL(包括5 μL的SYBR master mix，0.2 μL的引物，0.5 μL的GE loading，0.1 μL的ROX，2 μL的DNA，2.2 μL的TE)加入到標記1～12的樣品孔內，其中孔1～11加入DNA樣本，第12個孔加入NTC(無DNA對照)。再將芯片轉移至加樣器，點擊“l(fā)oad”進行樣品的加入。待樣品加樣完成后將芯片轉入BioMark數(shù)字PCR儀進行PCR擴增。擴增條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 40 s，45 cycles，PCR擴增結束后采用Fluidigm的Digital PCR analysis軟件進行分析處理。

微滴數(shù)字PCR(ddPCR)實驗操作步驟見之前的文獻報道[10～12]，微滴生成在微滴發(fā)生卡上進行：將配制好的含有DNA模板的PCR反應液20 μL(包括10 μL的EvaGreen master mix、0.4 μL的引物、4 μL的DNA、5.6 μL的TE)加入到標記有“Sample”的樣品孔內，加入60 μL的微滴生成油至標記有“Oil”孔內。然后將微滴發(fā)生卡轉移至微滴生成儀。待生成微滴后，轉移微滴至96孔板，然后進行PCR擴增。擴增好的96孔板在在微滴閱讀器上閱讀微滴。數(shù)據(jù)采用軟件QuantaSoft 1.7.4版本進行分析。

3 實驗結果與分析

3.1 熒光定量PCR方法

以大腸桿菌DNA文庫為模板使用上述PCR引物和擴增條件擴增后的得到的熔解曲線為一單峰，如圖1(a)所示，tm(DNA熔解溫度)為80 ℃左右；而以其它非特異性DNA作為模板，使用同一PCR引物和擴增條件進行擴增后得到的熔解曲線不是單一峰，如圖1(b)所示。

圖1 DNA文庫定量PCR擴增熔解曲線Fig.1 Melting curves of DNA library quantitative PCR amplification

因此，可以很清楚地根據(jù)熔解曲線來判斷該PCR方法具有良好的擴增特異性。

3.2 芯片式數(shù)字PCR

將優(yōu)化好的PCR方法及體系平行轉移至cdPCR平臺上進行絕對定量準確性及一致性研究。一張芯片12個孔，其中孔1～11加入DNA樣本，第12個孔加入NTC(無DNA對照)。擴增結果見圖2，首先從圖2中的陰性對照(NTC，Panel12)看，沒有熱點(深色點)出現(xiàn)，表明擴增體系中沒有DNA污染；其次看標準物質的擴增結果(Panel 9～11)，每個Panel中擴增得到的熱點(深色點)數(shù)目介于400～700之間(見表1)，λ即每個反應室內的平均分子數(shù)為1.22～1.28，且分布隨機。表明加入的起始DNA分子濃度適中，且得到了較好的擴增。

圖2 芯片數(shù)字PCR(cdPCR)擴增結果圖Fig.2 Amplification results of chip digital PCR (cdPCR)

3.3 微滴數(shù)字PCR

ddPCR擴增結果見圖3。擴增生成的總微滴數(shù)和陽性微滴數(shù)見表2。樣本擴增結果(F02)(通道1)得到了兩簇(陽性微滴和陰性微滴)微滴，表明建立的ddPCR方法得到了較好的擴增；而陰性對照(E05)擴增結果僅為一簇微滴，從熒光值判斷為陰性微滴，陽性微滴個數(shù)為0，表明擴增體系干凈無污染。

表1 每個Panel的陽性反應室數(shù)目和每個反應室內的平均DNA分子數(shù)Tab.1 Number of positive reaction chambers per Panel and average number of DNA molecules per reaction chamber

圖3 微滴數(shù)字PCR(ddPCR)擴增結果圖Fig.3 Amplification results of droplet digital PCR (ddPCR)

3.4 不同數(shù)字PCR平臺可比性

采用cdPCR和ddPCR對所研制的Level 2水平的文庫定量標準物質定值，考察不同平臺的一致性。對芯片每個單反應小室和每個微滴的體積進行修正后[13]，驗證結果表明對同一標準物質測定時兩種平臺測量結果一致(見表3和圖4)。

由于ddPCR方法中微滴數(shù)顯著多于cdPCR中的反應小室個數(shù)，所以ddPCR方法的精密度好于cdPCR方法的精密度，這與測量不確定度的評定結果一致。從表4可以看出ddPCR由測量方法精密度引入的不確定度ua顯著優(yōu)于cdPCR。綜合考慮所有不確定度來源，分別將其合成得到ddPCR和cdPCR的擴展不確定度，ddPCR優(yōu)于cdPCR。2個數(shù)字PCR平臺測量結果的不確定度分量見表4。

圖4 不同數(shù)字PCR平臺對同一標準物質量值的驗證結果Fig.4 Verification results of different digital PCR platforms on the same standard substance value

表2 微滴數(shù)字PCR陽性微滴數(shù)和總微滴數(shù)Tab.2 number of positive dorplets and total accepted droplets in droplet digital PCR

3.5 標準物質適用性驗證

制備了5個水平的文庫定量標準物質，其目的是用于制作熒光定量PCR的標準曲線來定量測定測序DNA文庫濃度，所以5個水平的標準物質經(jīng)過熒光定量PCR擴增后的線性需要進行檢驗。將制備好的5個不同水平的DNA文庫標準物質作為模板，采用建立的PCR擴增體系和擴增程序進行擴增，檢測結果如圖5(a)。以拷貝數(shù)對數(shù)為橫坐標，以Ct值為縱坐標得到的標準曲線為：y=-3.74x+38.87，R2=0.995，標準曲線的線性相關系數(shù)大于0.99，如圖5(b)，斜率對應的擴增效率為85%?？梢?個水平的標準物質經(jīng)過熒光定量PCR擴增后線性關系良好，可以作為DNA文庫定量的標準曲線。

表3 cdPCR和ddPCR對Level 2標準物質測定結果比較Tab.3 Comparison in measurement result of reference material of Level 2 determined by cdPCR and ddPCR

表4 cdPCR和ddPCR方法的測量結果不確定度評定Tab.4 Uncertainty evaluation of measurement result determined by ddPCR and cdPCR

圖5 5個水平文庫定量標準物質熒光定量PCR擴增曲線和標準曲線Fig.5 Fluorescence quantitative PCR amplification curves and standard curves of 5 level libraries

4 結 語

本文以主流的Illumina高通量測序平臺為對象，開展DNA文庫定量質量控制技術研究，建立了基于SYBR Green熒光染料嵌合的高特異性數(shù)字PCR絕對定量方法，用于DNA文庫定量標準物質的定值，并對制備的文庫定量標準物質的適用性進行了驗證。結果表明制備的5個水平的文庫定量標準物質線性良好，可以作為Illumina平臺DNA文庫定量的標準曲線。