曹冬英，李鷙，許文，隋利強，徐偉

(福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建省中藥炮制技術(shù)傳承基地，福建 福州 350122)

淡豆豉，為豆科植物大豆[Glycinemax(L.)Merr.]的成熟種子(黑豆)的發(fā)酵加工品[1]。性苦、辛，涼。歸肺、胃經(jīng)。具有解表，除煩，宣發(fā)郁熱的功效。可用于感冒，寒熱頭痛，煩躁胸悶，虛煩不眠等。淡豆豉中含有黃酮、皂苷、蛋白、多糖、氨基酸、纖溶酶等成分，其中黃酮類成分被認為是主要活性成分。淡豆豉具有降血糖、調(diào)節(jié)腸道菌群、抗菌、抗骨質(zhì)疏松及抗癌等藥理活性[2-6]。

前期課題組采用高效液相色譜法對市售不同廠家淡豆豉中黃酮類成分進行含量測定，建立了淡豆豉中6種黃酮類成分的含量測定方法[7-8]，在試驗過程中也發(fā)現(xiàn)，不同廠家淡豆豉所用原料黑豆不同，外觀有明顯差異。經(jīng)市場調(diào)研發(fā)現(xiàn)，目前市售黑豆主要有4種，故收集4種市售黑豆，分析其黃酮類成分含量，經(jīng)發(fā)酵后進一步分析其制品淡豆豉中黃酮類成分的差異，初步評價4種黑豆作為淡豆豉發(fā)酵原料的優(yōu)缺點，為淡豆豉的生產(chǎn)和原料控制提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；CPA225D型十萬分之一分析天平(德國Sartorius公司)；KQ-500E臺式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水儀(美國Millpore公司)。

1.2 材料與試劑 對照品大豆苷(批號：P14M10F83057)、黃豆黃苷(批號：P06J9F65073)、染料木苷(批號：P09M8F31018)、大豆苷元(批號：C06N6Y5504)、黃豆黃素(批號：G16J9C65571)、染料木素(批號：H30A9Z69019)，以上標準品均購于上海源葉生物科技有限公司。黑豆(市售)，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學車蘇容副教授鑒定為豆科植物大豆[Glycinemax(L.)Merr.]的成熟種子；桑葉(北京本草方源藥業(yè)集團有限公司，批號：20170508)經(jīng)福建中醫(yī)藥大學車蘇容副教授鑒定為?？浦参锷Morusalba(L.)]的葉；青蒿(安徽順和堂中藥飲片有限公司，批號：171201)經(jīng)福建中醫(yī)藥大學車蘇容副教授鑒定為菊科植物黃花蒿[Artemisiaannua(L.)]的干燥地上部分。甲醇、乙腈為色譜純(德國Merck公司)；甲酸為色譜純(上海阿拉丁試劑有限公司)；其他試劑均為分析純。

4種市售黑豆，購買自市場，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學車蘇容副教授鑒定3種為豆科植物大豆[Glycinemax(L.)Merr.]的成熟種子(黑豆)，分別習稱黃心小黑豆、綠心黑豆、黃心大黑豆，1種為蝶形花科菜豆屬植物(Phaseolusvulgaris)的成熟種子，習稱黑蕓豆。4種市售黑豆樣品見圖1。

樣1.黃心小黑豆;樣2.黑蕓豆;樣3.綠心黑豆;樣4.黃心大黑豆;樣1-1.黃心小黑豆淡豆豉;樣2-1.黑蕓豆淡豆豉;樣3-1.綠心黑豆淡豆豉;樣4-1.黃心大黑豆淡豆豉

2 方法

2.1 色譜條件 Welch Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為甲醇(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫(0～7 min，25%～30% A;7～12 min，30%～45% A；12～20 min，45%～45% A；20～27 min，45%～60% A；27～33 min，60%～75% A；33～35 min，75%～25% A；35～40 min，25%～25% A)，流速0.8 mL·min-1，柱溫30 ℃，進樣量10 μL，檢測波長254 nm。6種對照品理論板數(shù)均大于5 000。樣品和對照品高效液相色譜(HPLC)色譜圖見圖2。

A.混合對照品；B.淡豆豉樣品 1.大豆苷；2.黃豆黃苷；3.染料木苷；4.大豆苷元；5.黃豆黃素；6.染料木素圖2 對照品及淡豆豉樣品HPLC色譜圖

2.2 溶液配制

2.2.1 混合對照品溶液制備 精密稱取對照品大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素適量，加入甲醇超聲溶解，制成濃度分別為530、240、564、550、242和508 μg·mL-1的單一對照品儲備液，備用。分別精密量取上述對照品溶液適量，置同一容量瓶中，加50%甲醇至刻度，即得大豆苷53 μg·mL-1、黃豆黃苷24 μg·mL-1、染料木苷56.4 μg·mL-1、大豆苷元55 μg·mL-1、黃豆黃素24.2 μg·mL-1和染料木素50.8 μg·mL-1混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備[1，7-11]將自制淡豆豉樣品60 ℃干燥,粉碎,精密稱取1 g,置50 mL錐形瓶中，精密加入25 mL色譜甲醇，混勻,超聲處理30 min(功率250 W，頻率50 kHz)，放冷，再次稱重，甲醇補足減失重，搖勻，進樣前用0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，得供試品溶液。

2.3 標準曲線的制備 精密稱取各標準品，甲醇超聲溶解、定容5 mL容量瓶。大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素,稀釋用50%甲醇為不同梯度濃度的混合對照品溶液。按照“2.1”項下色譜條件測定。以大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素質(zhì)量濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)r，結(jié)果見表1。

表1 淡豆豉中6中化合物的線性范圍考察

2.4 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，1 d內(nèi)連續(xù)進樣6次，計算大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素峰面積RSD分別為0.64%、0.43%、0.56%、0.63%、0.56%、0.58%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5 重復性試驗 精密稱取以黃心小黑豆為原料發(fā)酵的淡豆豉粉末，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下測定各成分的峰面積，帶入標準曲線計算大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的平均含量分別為236.0、47.67、355.1、385.6、38.23、236.9 μg·g-1，RSD分別為4.39%、4.27%、4.18%、1.65%、3.98%、2.21%，結(jié)果表明方法重復性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取以黃心小黑豆為原料發(fā)酵的淡豆豉粉末，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、和24 h按“1.2”項下測定大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的峰面積，結(jié)果RSD分別為0.81%、1.08%、1.40%、0.67%、1.57%、0.68%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗 取重復性試驗同批次淡豆豉粉末約0.5 g，精密稱定，平行6份，每份分別精密加入近似等量的6種對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下測定各成分的峰面積，計算各個化合物的回收率和回收率的RSD結(jié)果見表2，結(jié)果表明該方法回收率良好。

表2 淡豆豉中6個黃酮類成分回收率試驗結(jié)果

表2(續(xù))

3 結(jié)果

用上述建立的方法對4種黑豆及淡豆豉中6黃酮類成分的含量進行測定,對測定結(jié)果進行比較。結(jié)果見表3。

表3 4種淡豆豉發(fā)酵前后異黃酮含量比較

將上述結(jié)果用柱形圖表示，如圖3。

1.黃心小黑豆;2.黑蕓豆;3.綠心黑豆;4.黃心大黑豆圖3 4種黑豆及發(fā)酵后淡豆豉中6種黃酮類成分含量比較

4 討論

4.1 由圖2可知，2號樣品(黑蕓豆)中6種黃酮類成分未檢測到，雖外形與黑豆相似，實際不能作為淡豆豉發(fā)酵原料。其余3種黑豆6種黃酮類成分含量差異性大，其中黃心小黑豆中3種黃酮苷類成分含量最高，黃心大黑豆次之，綠心黑豆黃酮苷類成分含量最低；發(fā)酵后的淡豆豉中6種黃酮類成分含量也有明顯差異，其中以黃心小黑豆中黃酮苷元含量最高，黃心大黑豆次之，綠心黑豆苷元含量最低。淡豆豉中苷元含量的高低與其療效密不可分，據(jù)文獻報道異黃酮類苷元抗骨質(zhì)疏松作用優(yōu)于異黃酮苷類[12]，此外，苷元與苷相比，更利于人體吸收，故黃心小黑豆作為淡豆豉的發(fā)酵原料可能更為適宜。

4.2 從淡豆豉本草考證中可以看出歷代本草發(fā)酵淡豆豉大多以黑豆作為原料[13-15]。明·陳嘉謨《本草蒙筌》云：“黑白種殊，惟取黑者入藥；大小顆粒，須求小粒煎湯。緊小者為雄豆，入藥方效”[16]，福州淡豆豉傳統(tǒng)制備方法中原料也以黃心小黑豆為主。在淡豆豉發(fā)酵過程中，幾種黑豆在洗去表面菌絲時，黃心小黑豆的質(zhì)地最為堅硬，不易脫皮，更利于保持成品的外觀。故推測黃心小黑豆為淡豆豉發(fā)酵的較優(yōu)原料。

4.3 根據(jù)文獻報道[1,7-11,17]，淡豆豉中黃酮苷及苷元的提取方法有加熱回流法、索氏提取法、超聲波法等，所用溶劑包括甲醇、80%甲醇、70%乙醇。本試驗主要為比較市售黑豆及成品淡豆豉中黃酮苷及苷元含量，前期試驗表明，選用甲醇超聲提取法可滿足試驗要求[8]。今后試驗可通過不同提取方法比較、驗證，對該方法進行改進。

本試驗所測成分為大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素；桑葉中含槲皮素、紅景天苷、鼠李素-3-O-半乳糖苷等黃酮類成分[18]，青蒿中含有蒿黃素、貓眼草黃素等黃酮類成分[19]，但沒有大豆苷及大豆苷元等成分，淡豆豉加工所用輔料桑葉、青蒿對本試驗所測成分不產(chǎn)生干擾。

致謝：感謝福建省中藥制劑與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心(Fujian Research Center of Preparation and Quality Control Engineering Technology of Traditional Chinese Medicine)為本試驗提供科研平臺。