聶延君，鄭靜，徐玉文

(山東省食品藥品檢驗研究院，仿制藥研究與評價重點實驗室，山東省仿制藥一致性評價工程技術研究中心，山東 濟南 250101)

吡拉西坦(Piracetam)是一種作用于中樞神經系統(tǒng)的益智藥，比利時UCB研究所于1963年合成成功，適用多種原因所致的記憶減退及輕、中度腦功能障礙；也用于兒童智能發(fā)育遲緩[1-5]。吡拉西坦顆?，F(xiàn)行標準為國家局WS-10001-(HD)-1132-2002，現(xiàn)行標準中沒有有關物質檢查，對本品安全性缺少控制。含量測定則采用凱氏定氮法，檢驗過程中樣品處理復雜煩瑣，氮消解過程時間長，試驗過程中加熱溫度和時間對反應終點均有較大影響。因此，為提高本品質量，簡便操作，本文建立了高效液相色譜(HPLC)法測定吡拉西坦顆粒有關物質和含量，以期為質量標準提高提供技術支持。

圖1 吡拉西坦和相關雜質結構

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)，Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)。

1.2 試藥 原料藥(東北某有限公司，批號：030180672)；吡拉西坦顆粒(江西某公司，批號：201752，201822和201824)；吡拉西坦對照品(中國食品藥品檢驗研究院，批號：100386-201703，含量：100.0%)；雜質A(中國食品藥品檢驗研究院，批號：190154-201501，含量：98.9%)；雜質D對照品(EP，批號：2426-054A5，含量：98.1%)。乙腈為色譜純，鹽酸、過氧化氫、磷酸氫二鉀均為分析純。

2 方法與結果

2.1 有關物質檢查方法[6]色譜柱為Kromasil 100-5 C18(4.6 nm×250 mm，5 μm)；流動相A為0.1%磷酸氫二鉀溶液(用磷酸調節(jié)pH值至6.0±0.05)，流動相B為乙腈，梯度洗脫(0～20 min，95%A→80%A；20～28 min，80%A；28～28.1 min，95%A；28.1～40 min，95%A)。流速為每分鐘1.0 mL；檢測波長為205 nm，柱溫35 ℃。進樣量20 μL。系統(tǒng)適用性溶液：取吡拉西坦對照品約25 mg，進行堿破壞后，加雜質A對照品10 μL，稀釋至刻度，搖勻。系統(tǒng)適用性要求：雜質D峰相對吡拉西坦峰的保留時間約為0.72，吡拉西坦峰與雜質A峰的分離度應大于3.0，吡拉西坦峰的拖尾因子應小于2.0。供試品溶液濃度為0.5 mg·mL-1，對照溶液濃度為0.5 μg·mL-1。

1.雜質D；2.吡拉西坦；3.雜質A圖2 系統(tǒng)適用性圖譜

2.2 方法學驗證

2.2.1 專屬性試驗 采用強酸、強堿、氧化、加熱和光照的方式對吡拉西坦進行破壞性試驗，結果各降解雜質與吡拉西坦主峰以及雜質之間的分離度均良好，能夠實現(xiàn)有效分離，其中雜質D為主要降解雜質。

2.2.2 精密度試驗 取吡拉西坦對照溶液(0.5 μg·mL-1)，精密量取20 μL照上述色譜條件連續(xù)進樣6次，結果峰面積RSD為0.38%，說明該方法的精密度較高。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 取吡拉西坦顆粒供試品溶液(批號：20180202)按“2.1”項下方法制備一份供試品溶液，分別于0、2、4、6、8 h，按上述色譜條件測定，記錄峰面積。結果雜質D峰面積RSD為0.18%，其他單雜峰面積RSD為0.05%，總雜質RSD為0.56%，表明供試品溶液在8 h內穩(wěn)定性良好。

2.2.4 線性關系考察 精密稱取吡拉西坦對照品適量制成每1 mL中含吡拉西坦0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 μg的溶液，作為線性溶液。照上述色譜條件分別精密量取20 μL進樣測定，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。結果吡拉西坦在0.10～1.00 μg·mL-1范圍內線性關系良好(Y=43 829X+1 652.1，相關系數r為0.999 0)。

2.2.5 準確度試驗 分別精密稱取吡拉西坦對照品適量，按處方量稱入空白輔料，加乙腈-水(5∶95)溶解并過濾，取續(xù)濾液供試品溶液，分別制成每1 mL含吡拉西坦0.10、0.50、0.75 μg的溶液，每個濃度配制3份，照上述色譜條件精密量取20 μL進樣。結果回收率平均值為97.1%。說明該方法的回收率良好。

表1 準確度試驗結果表

2.2.6 檢出限與定量限 分別取吡拉西坦對照品適量，加乙腈-水(5∶95)溶解并逐級稀釋，定容，進樣，當吡拉西坦峰信噪比(S/N)為3時，即為檢出限，結果為0.01 μg·mL-1。在信噪比(S/N)為10時，即為定量限，結果為0.03 μg·mL-1。

2.2.7 耐用性試驗 分別采用調整柱溫(30、35、40 ℃)、色譜柱和高效液相色譜儀的方法進行耐用性試驗，結果，各條件下均能滿足系統(tǒng)適用性要求，說明該方法耐用性較好。

2.3 含量測定方法 參照有關物質方法， 采用Kromasil 100-5 C18；流動相為0.1%磷酸氫二鉀溶液(用磷酸調節(jié)pH值至6.0±0.05)-乙腈(95∶5)，由梯度洗脫調整為等度洗脫。檢測波長為205 nm，流速為每分鐘1.0 mL。供試品和對照品溶液濃度均為0.1 mg·mL-1的溶液。精密量取供試品溶液與對照品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算。

A.酸破壞；B.堿破壞；C.氧化破壞；D.熱破壞；E.光破壞 1.雜質D；2.吡拉西坦；3.其他雜質圖3 專屬性試驗圖譜

表2 耐用性匯總表

2.4 樣品測定 根據“2.1”和“2.3”項下的有關物質和含量測定方法，對樣品進行測定，具體結果見表3。

表3 有關物質檢驗結果匯總表

3 討論

3.1 吡拉西坦顆粒的每天服用量較大，一般為每天2.4～4.8 g，現(xiàn)行標準沒有設定有關物質檢查，不能客觀反映樣品中雜質情況，屬于安全性項目缺失，存在用藥安全隱患，因此需增訂有關物質。對酸、堿、氧化、高溫、光照等破壞性試驗產生的降解產物分析，雜質D是主要的降解產物，因此雜質D能間接反映樣品的生產工藝、處方以及貯存條件變化情況，對吡拉西坦顆粒質量控制具有重要意義，而雜質A為主要的工藝雜質，因此將雜質A和D作為已知雜質進行重點控制。按照ICH雜質限量研究的指導原則，將雜質A、D的限度擬定為不得過0.15%。其他單個雜質不得過0.1%，雜質總和不得過0.5%。

3.2 現(xiàn)行標準中含量測定采用凱氏定氮法，檢驗過程中樣品和空白對照的處理復雜煩瑣，消解時間長，試驗過程中需控制加熱溫度和時間，多種因素均可對反應終點有較大影響，容易造成試驗結果準確度差的問題?！吨袊幍洹?015年版中吡拉西坦原料及相關制劑(口服溶液、片劑、注射液、膠囊)均采用高效液相色譜法測定含量[7]，制劑企業(yè)也有升級質量標準的要求。因此，為了統(tǒng)一標準，簡便操作，含量測定方法修訂為HPLC法，該方法簡便、準確、可行，檢測結果與現(xiàn)行結果比較，基本一致，因此可用于吡拉西坦顆粒的質量控制。