段凱旋，劉志強，王博龍

(1.宜春學(xué)院，江西 宜春 336000；2.鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 鶴壁 458030)

中藥復(fù)方是中華民族使用天然藥物千百年的經(jīng)驗結(jié)晶，由于其化學(xué)成分復(fù)雜，導(dǎo)致藥效物質(zhì)不明。復(fù)方藥效物質(zhì)的研究方法有多種，其中通過分析復(fù)方口服給藥后血中移行成分，確定其體內(nèi)直接作用物質(zhì)，已成為快速確定復(fù)方藥效物質(zhì)的有效途徑之一[1]。丹參川芎嗪注射液主要有效成分均是對腦血管治療的有效藥物,現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)[2]丹參素具有溶解纖維蛋白,降低血液黏度,改善微循環(huán)的作用，而川芎嗪則可以擴張腦血管,預(yù)防血小板凝聚,降低腦耗氧量。目前針對丹參川芎嗪注射液的藥理學(xué)研究已有一些報道，但其治療腦梗死的作用機制研究尚未完全明確。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是融合了藥學(xué)、生物學(xué)、計算機學(xué)及復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析等多學(xué)科的新技術(shù)與新成果，在預(yù)測和辨識中藥活性成分群及作用靶點、闡明作用機制、解釋組方規(guī)律、發(fā)現(xiàn)新適應(yīng)證及新活性化合物等方面，具有獨特優(yōu)勢和巨大潛力[3]。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對其治療腦梗死的作用機制進(jìn)行研究，以期望為后續(xù)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 入血成分治療腦梗死靶點篩選及其網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)文獻(xiàn)報道[4-5]確定丹參川芎嗪注射液14種入血成分(見表1)，并通過TCMSP(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetSprediction.ch/)檢索丹參川芎嗪注射液入血成分靶點，然后利用UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將靶點轉(zhuǎn)換成對應(yīng)靶點。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)以“Cerebral infarction、Ischemic stroke”為檢索詞，搜索腦梗死靶點，將腦梗死靶基因與丹參川芎嗪注射液入血成分靶點同時輸入Venny 2.1軟件(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)，篩得二者靶基因交集作為作用靶點，將入血成分及其靶點導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建入血成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

表1 丹參川芎嗪注射液入血成分

1.2 靶點的相互作用研究 將篩選得到的作用靶點導(dǎo)入STRING平臺(https://string-db.org/)構(gòu)建靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction，PPI)，設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為“medium confidence”，其他參數(shù)保持默認(rèn)值。將 PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，利用“Network Analysis”功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治龊Y選出關(guān)鍵靶點。

1.3 關(guān)鍵靶點的KEGG通路研究 利用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(KEGG)信號通路分析，物種與背景設(shè)置均為“Homo sapiens”(智人)進(jìn)行操作，研究靶點投射的 KEGG 信號通路與疾病之間的相互關(guān)系，并通過Omicshare軟件 (http://www.omicshare.com/tools/index.php/)，對富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化分析，明確其治療腦梗死的主要藥理機制。

2 結(jié)果

2.1 入血成分治療腦梗死靶點及其網(wǎng)絡(luò)圖 將TCMSP、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫檢索得到的146個入血成分靶點，與Gene cards數(shù)據(jù)庫挖掘到的2 538個腦梗死靶點篩重，得到83個入血成分治療腦梗死的靶點(見圖1)。圖2為入血成分-治療腦梗死靶點網(wǎng)絡(luò)圖，共有個124節(jié)點，235條邊，每個入血成分均能作用于多個治療腦梗死的靶點，體現(xiàn)了丹參川芎嗪注射液治療腦梗死具有多成分、多靶點的特征。

圖1 腦梗死-入血成分靶點韋恩圖

圖2 入血成分治療腦梗死靶點網(wǎng)絡(luò)圖(菱形：丹參川芎嗪注射液；圓形：入血成分；三角形：腦梗死；橢圓形：作用靶點)

2.2 靶點PPI網(wǎng)絡(luò)分析 如圖3所示，PPI網(wǎng)絡(luò)共有82個節(jié)點(1個靶點未參與)，686條相互作用連線，每個參與互作的蛋白節(jié)點用一個圓圈表示，圓圈面積越大表示其度值越大，圓圈周線越粗代表其介數(shù)越大，PPI關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)平均度值為16，平均介數(shù)為1.2×10-2，均超過平均值的靶點共有18個(見表2)，以此作為治療腦梗死的關(guān)鍵靶點。

圖3 靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

表2 關(guān)鍵靶點及其拓?fù)鋮?shù)

2.3 關(guān)鍵靶點的KEGG通路分析 以P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，富集18個關(guān)鍵靶點的KEGG通路，如圖4所示33條信號通路，其中與腦梗死密切相關(guān)的有PI3K-Akt信號通路、VEGF信號通路、TNF信號通路、雌激素信號通路和血小板激活等。

圖4 KEGG信號通路點狀圖

3 討論

腦梗死又稱缺血性腦卒中，屬于中醫(yī)中風(fēng)范疇，其發(fā)病常與風(fēng)、火、痰、虛、瘀等因素相關(guān)。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，瘀血貫穿于該病發(fā)生、發(fā)展的始終，因此以活血化瘀、補氣養(yǎng)血為施治原則。隨著現(xiàn)代人們生活節(jié)奏加快和飲食結(jié)構(gòu)不良，腦梗死發(fā)病率上升，且發(fā)病人群呈年輕化的趨勢。丹參和川芎是經(jīng)典的活血化瘀類中藥，由其有效成分精制而成的中藥注射液，廣泛應(yīng)用于腦梗死的臨床治療，但其藥效成分眾多，作用靶點及機制尚未完全揭示。

本研究以丹參川芎嗪注射液中丹參素、丹酚酸B、川芎嗪等14種入血成分為研究對象，預(yù)測出NOS3、VEGFA、IL-4、IL-2、F2等關(guān)鍵藥效靶點，而實驗也證實丹參川芎嗪注射液有效成分能夠直接或間接作用于這些靶點。如NOS3又稱eNOS，是內(nèi)皮型一氧化氮合酶，能夠催化血管內(nèi)皮細(xì)胞合成一氧化氮(NO)，而NO是重要的血管舒張因子，能夠擴展血管改善腦梗死區(qū)域的血液供應(yīng)。程先超等[6]發(fā)現(xiàn)川芎嗪可升高血漿中NO水平，改善腦部微循環(huán)，增加局部腦血流量，保護(hù)缺血區(qū)腦組織。F2在凝血機制中起著中心作用，可以激活纖維蛋白原，誘導(dǎo)血小板聚集，導(dǎo)致血栓形成，而丹參川芎嗪注射液能明顯降低腦梗早期患者血清F2水平[7]。VEGFA是VEGF主要的亞型，具有誘導(dǎo)血管新生、促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖等生物活性[8]。薛亮等[9]研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B能夠促進(jìn)VEGF mRNA的表達(dá)，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。此外，川芎嗪、丹參素還可以下調(diào)白介素減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[10-11]，且聯(lián)合應(yīng)用對缺氧損傷的血管平滑細(xì)胞具有一定的協(xié)同保護(hù)作用[12]。由此可見，無論是從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測還是他人實驗結(jié)果來看，丹參川芎嗪注射液主要通過上述靶點，來改善微循環(huán)、抗凝、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮治療腦梗死作用。

通路富集可有效了解丹參川芎嗪注射液靶點的整體協(xié)同作用，KEGG通路研究顯示靶點主要富集在PI3K-Akt信號通路、VEGF信號通路、TNF信號通路、雌激素信號通路和血小板激活等。其中PI3K-Akt被認(rèn)為是缺氧缺血后腦細(xì)胞凋亡的主要信號通路，調(diào)控PI3K-Akt能夠減輕腦損傷。雖無丹參川芎嗪注射液調(diào)控PI3K-Akt信號通路治療腦梗死的實驗，但已證實丹參酮IIA、川芎嗪能通過調(diào)控PI3K-Akt通路促進(jìn)心肌細(xì)胞存活、縮小梗死面積，而防治心肌缺血再灌注損傷[13-14]。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對丹參川芎嗪注射液入血成分的作用靶點及其信號通路進(jìn)行了系統(tǒng)研究，為丹參川芎嗪注射液的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。