曹家楨，王富春，趙晉瑩，劉雁澤,李 鐵,哈麗娟

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117）

胃潰瘍是常見的慢性胃腸道消化疾病，是由多種內(nèi)源性或外源性因素如外界應(yīng)激、幽門螺桿菌感染、非甾體類抗炎藥及不良生活習(xí)慣等因素造成，導(dǎo)致侵入性因子（胃酸—胃蛋白酶）和防御性因子（黏液—碳酸氫鹽）失衡[1]，造成胃黏膜及肌層受損或壞死，誘發(fā)潰瘍性病變，以胃黏膜損傷形成潰瘍灶或伴有穿孔出血為主要表現(xiàn)[2]。近年來，超微弱發(fā)光（Ultraweak-emission,UPE）技術(shù)逐漸在臨床診斷及基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中得到應(yīng)用，其中以電荷耦合器件（charge-coupled device，CCD）為主的圖像采集系統(tǒng)通過采集光子計數(shù)形成二維圖像，以獲取生物體的UPE 強(qiáng)度的時間及空間信息，多用于檢測生物體的自發(fā)輻射情況[3]。為了在不損傷動物的情況下觀察胃潰瘍造模情況，運(yùn)用活體成像監(jiān)測是研究的關(guān)鍵手段之一。本研究擬采用UPE 技術(shù)，以應(yīng)激性胃潰瘍小鼠模型為觀察對象，通過CCD 圖像采集系統(tǒng)觀察其自發(fā)光光子強(qiáng)度及圖像情況，判斷胃潰瘍造模成功與否，從而為探索胃潰瘍的相關(guān)機(jī)制研究奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 選用SPF 級雄性DBA/1J 小鼠16 只，體質(zhì)量（15±2）g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2016-0011。飼養(yǎng)于長春中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿研究所動物房，飼養(yǎng)條件：環(huán)境溫度（20±3）℃，濕度（50±2）%，12 h 明暗交替，自由攝食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。采用完全隨機(jī)法進(jìn)行分組，空白組8 只，模型組8 只。實驗過程嚴(yán)格遵循國家衛(wèi)生研究院實驗動物護(hù)理與使用指南。

1.2 主要試劑和儀器 魯米諾單鈉鹽（阿法埃莎化學(xué)有限公司），PBS 磷酸鹽緩沖粉劑（北京鼎國昌盛公司），異氟烷（河北一品制藥股份有限公司），恒溫水箱（常州諾基公司），CCD 圖像采集系統(tǒng)（iXon 888，北愛爾蘭Andor公司），小動物呼吸麻醉機(jī)（Matrx VIP3000，美國MIDMARK 公司）

1.3 造模方法 造模方法采用冷水束縛應(yīng)激法[4]，將模型組小鼠禁食不禁水24 h，放入由50 mL 離心管自制的冷束縛裝置中，使小鼠保持站立姿勢。在離心管上部制造通氣孔，以使小鼠在整個冷束縛過程中保持正常呼吸，并在側(cè)壁制造多個孔洞，使冷水流入離心管內(nèi)，保持內(nèi)外水溫一致。將冷束縛裝置固定在釘板上，放置進(jìn)恒溫水箱中，使水平面保持在胸骨劍突位置，水溫（22±2）℃，4 h 后將小鼠取出。

1.4 CCD 圖像采集系統(tǒng) 整個實驗測試在暗室內(nèi)完成，該暗室內(nèi)無任何光源，墻壁及地面均刷黑色油漆，無任何磷光或合成色，溫度保持在（20±1.0）℃，暗室內(nèi)儀器的布局如圖1 所示。實驗人員在進(jìn)入暗室前將飾品、金屬物品等發(fā)光物品卸下，用中性香皂（無香味、無酒精）清洗手部。進(jìn)入暗室后，更換黑色工作服。實驗過程中的照明均采用自制的紅光手電筒，經(jīng)測試這種光對測試結(jié)果無影響。

CCD 圖像采集系統(tǒng)采用背照式CCD 201 相機(jī)，像素分辨率為1024×1024，像素大小為13 μm2，暗電流每秒＜1 電子/像素。使用0.95/25 mm 氙氣透鏡，附帶有16 mm 圖像傳感器，最大光圈f=0.95，使其在低光照條件下也能提供良好質(zhì)量的圖像。相機(jī)光譜靈敏度范圍約為200～1 000 nm，在575 nm 時達(dá)到量子效率峰值（92%）。該系統(tǒng)配備有冷卻頭及水冷式冷卻機(jī)，最低可將CCD 相機(jī)溫度維持在-120 ℃。

圖1 暗室內(nèi)布局

1.5 觀察指標(biāo) CCD 成像觀察：將小鼠及小動物呼吸麻醉機(jī)提前放置在暗室內(nèi)，進(jìn)行2 h 暗適應(yīng)。以2.5%濃度的異氟烷0.5 L/min 麻醉條件下完成誘導(dǎo)麻醉后，放置在觀察臺上，以1.5%濃度異氟烷0.5 L/min 的麻醉條件維持麻醉，小鼠呈仰臥位。采用Andor Solis 4.3圖像采集軟件運(yùn)行Single 模式對小鼠胃部在體表投影位置進(jìn)行拍照，以確保鏡頭在小鼠胃部正上方，兩者之間距離為30 cm。在確定位置之后，以Accumlate 模式對小鼠進(jìn)行圖像采集15 min。完成后按體質(zhì)量濃度10 μL/g 對每只小鼠腹腔注射相應(yīng)量的0.01 mg/μL 魯米諾溶液。魯米諾[5]是一種小分子光子供體，可被活性氧（ROS）激活產(chǎn)生更強(qiáng)的光子，是常用的光子增強(qiáng)劑，對生物無危害。2 min 后再以Accumlate 模式進(jìn)行圖像采集15 min，觀察CCD 成像情況。

光子強(qiáng)度：運(yùn)用Andor Solis 4.3 軟件選定小鼠左上腹部為測試部位，對其范圍內(nèi)的光子強(qiáng)度進(jìn)行數(shù)字化提取，導(dǎo)出到Excel 表格中，定量分析2 組小鼠組內(nèi)及組間注射魯米諾前后光子強(qiáng)度差異。

胃黏膜觀察及潰瘍指數(shù)評分：測試完成后將小鼠從暗室取出，頸椎脫臼處死，立即剖腹取胃，沿胃大彎剪開胃壁，用磷酸鹽緩沖液（PBS）在冰上對胃黏膜進(jìn)行漂洗數(shù)次后，將胃黏膜展開，平鋪于顯微鏡下，以10 倍視野觀察并按Guth 標(biāo)準(zhǔn)計算胃黏膜損傷指數(shù)[6]：斑點糜爛計1 分，糜爛直徑＜1 mm 為2 分，1 mm ＜糜爛直徑＜2 mm 之間計3 分，2 mm ＜糜爛直徑≤4 mm 計4 分，糜爛直徑＞4 mm 計5 分，寬度＞2 mm 時分值×2，最后所得分相加為潰瘍指數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)檢驗和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布的以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。組內(nèi)比較用配對t檢驗，組間比較用獨立樣本t檢驗，以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組小鼠CCD 圖像觀察 從采集的圖像可觀察到CCD 相機(jī)在暗室環(huán)境下均可捕捉到小鼠圖像。通過肉眼觀察，小鼠整體輪廓清晰，且2 組小鼠胃部圖像無顯著差異。在注射魯米諾后，模型組小鼠左上腹部近胃部光子強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，并可出現(xiàn)白色圓形光團(tuán)；空白組小鼠無明顯改變，見圖2。

圖2 各組小鼠UPE 圖像

2.2 2 組小鼠胃部光子強(qiáng)度比較 見表1。

2.3 2 組潰瘍損傷指數(shù)比較 空白組小鼠胃黏膜光滑，無黏膜糜爛、出血等損傷；模型組小鼠胃竇部有條形點或片狀出血糜爛灶，直徑＜2.5 mm；Guth 指數(shù)為（3.13±0.64）分，2 組有顯著差異（P＜0.05），提示造模成功。

表1 2 組小鼠胃部光子強(qiáng)度比較（）

表1 2 組小鼠胃部光子強(qiáng)度比較（）

注：與空白組注射魯米諾前比較，# P ＜0.05；與空白組注射魯米諾后比較，△P ＜0.05；與模型組注射魯米諾前比較，▲P ＜0.05

3 討論

目前，生物光學(xué)成像技術(shù)已成為生物醫(yī)學(xué)研究的重要工具，將新型宏觀光子成像技術(shù)與數(shù)字化分析手段結(jié)合，為研究人員提供了多種可視化生物觀察技術(shù)的同時，也提供了科學(xué)的研究技術(shù)。UPE 技術(shù)作為一種非侵入性監(jiān)測手段，能有效的對機(jī)體生理、病理情況進(jìn)行長期觀察。特別是以CCD 為主的圖像采集系統(tǒng)在實驗研究中被廣泛實使用。

本研究通過采集CCD 圖像與光子能量的差異變化驗證胃潰瘍小鼠的造模成功與否，確定UPE 技術(shù)為觀察胃潰瘍造模成功的有利手段。通過本方法，不需要將小鼠解剖觀察胃黏膜損傷指數(shù)，可以在活體狀態(tài)下觀察胃潰瘍造模的成功情況，確立胃潰瘍模型，節(jié)約實驗成本、人力及物力資源，為實驗的后續(xù)研究奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。本次實驗通過對束縛冷應(yīng)激之一造模方法進(jìn)行胃潰瘍的造模及光子強(qiáng)度的判斷，既對胃潰瘍的機(jī)制研究提供了理論依據(jù)，且為后續(xù)針刺治療胃潰瘍的機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。