李育敏， 蔡欽泉， 金 瀟， 覃俊龍， 陳亞瓊， 莫云均， 李 瑞， 張秀明

（1. 深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518001；2. 深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院感染管理科，廣東 深圳 518001）

異常血紅蛋白（hemoglobin，Hb）是由于珠蛋白基因缺陷使珠蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致Hb分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變異的一組遺傳性Hb病[1]。Hb NewYork是由于β珠蛋白肽鏈第113位密碼子GTG→GAG突變，使該位點(diǎn)谷氨酸代替甘氨酸，引起β鏈G螺旋段構(gòu)象改變所致。秦良誼[2]對(duì)我國β鏈異常Hb進(jìn)行大規(guī)模群體遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，Hb NewYork在我國南方地區(qū)β鏈異常Hb分布中居第2位，僅次于HbE。由于不同年齡段及性別血液學(xué)參數(shù)存在差異，且大部分進(jìn)行Hb電泳篩查的成年女性為妊娠期，存在生理性貧血可能，因此本研究通過對(duì)Hb NewYork進(jìn)行篩查，并按年齡段及性別分析其血液學(xué)特征，為Hb NewYork的遺傳學(xué)研究提供系統(tǒng)、詳細(xì)的參考資料。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年6月—2019年5月在深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院進(jìn)行Hb檢測的72 397名成人及新生兒。對(duì)檢出Hb NewYork者按年齡及性別分為新生兒組、成年男性組和成年女性組。

1.2 儀器與試劑

XN-1000全自動(dòng)血液分析儀及配套試劑（日本Sysmex公司），Capillarys 2全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀及配套試劑（法國Sebia公司），T960擴(kuò)增儀（珠海黑馬公司），ChemiDoc MP全自動(dòng)凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad公司），DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠），YN-H16恒溫雜交儀（深圳亞能公司），3730XL遺傳分析儀（美國ABI公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 采集成人外周靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝，2～8 ℃保存，用于紅細(xì)胞參數(shù)檢測和Hb電泳分析。采集新生兒臍帶血2 mL，肝素鋰抗凝，2～8 ℃保存，用于Hb電泳分析。

1.3.2 血液學(xué)分析 采用XN-1000全自動(dòng)血液分析儀及配套試劑檢測Hb、紅細(xì)胞平均體積（mean corpuscular volume，MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）。采用毛細(xì)管電泳法進(jìn)行Hb分析，鑒別Hb條帶的類型及分析各條帶的相對(duì)比例。嚴(yán)格均按儀器和試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.3 地中海貧血（簡稱地貧）基因檢測 采用跨越斷裂點(diǎn)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測3種中國人群常見缺失型α地貧基因（--SEA、-α3.7和-α4.2）。采用PCR結(jié)合反向點(diǎn)雜交檢測常見3種非缺失α地貧基因（αQS、αCS、αWS）和17種β地貧基因點(diǎn)突變類型（-28、-29、CD17、CD41-42、CD43、βE、CD71-72、IVS-Ⅱ-654、-32、-30、CAP、Initiation condon、CD14-15、CD27-28、IVS-Ⅰ-1、IVS-Ⅰ-5、CD31）。嚴(yán)格按儀器和試劑盒說明書進(jìn)行操作及結(jié)果判讀。

1.3.4 珠蛋白基因序列分析 珠蛋白基因測序由深圳亞能公司檢測。采用PCR擴(kuò)增β珠蛋白基因，Sanger雙脫氧鏈終止法進(jìn)行珠蛋白基因序列測定，Vector NET 8.0軟件進(jìn)行測序結(jié)果比對(duì)，在人類異常Hb和地貧數(shù)據(jù)庫（http：//globin.bx.psu.edu）中查找突變位點(diǎn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，連續(xù)變量采用x±s表示。

2 結(jié)果

2.1 基因型分析

DNA測序檢出64例Hb NewYork，均為雜合子，發(fā)生率為0.088%（64/72 397），包括62例單純Hb NewYork雜合子，其中成人57例（男21例、女36例），新生兒5例；1例Hb NewYork復(fù)合-α3.7雜合缺失和1例Hb NewYork復(fù)合IVS-Ⅱ-81雜合突變（圖1），均為成人。

2.2 血液學(xué)表型分析

成人單純Hb NewYork雜合子、Hb NewYork復(fù)合-α3.7雜合缺失和Hb NewYork復(fù)合IVS-Ⅱ-81雜合突變（C＞T）血液學(xué)表型正常，具體結(jié)果見表1。5例新生兒Hb NewYork雜合子的Hb NewYork含量為（4.7±0.6）%，毛細(xì)管電泳分析結(jié)果見表2。

圖1 Hb NewYork復(fù)合IVS--81雜合突變的測序圖

表1 成人Hb NewYork的血液學(xué)表型

表2 5例新生兒Hb NewYork雜合子的毛細(xì)管電泳分析

3 討論

我國南方地區(qū)高發(fā)的β鏈異常Hb主要為HbE、Hb NewYork和Hb J-Bangkok等[2-5]。廣西地區(qū)Hb NewYork發(fā)生率為0.12%[3]，廣東梅州地區(qū)為0.079%[6]，韶關(guān)地區(qū)為0.062%[7]，深圳地區(qū)為0.101%[8]，本研究結(jié)果為0.088%，高于韶關(guān)和梅州地區(qū)[6-7]，但低于冉健等[5]報(bào)道的深圳地區(qū)Hb NewYork發(fā)生率（0.115%），這可能與樣本選擇有關(guān)。冉健等[5]選擇深圳地區(qū)妊娠婦女作為調(diào)查對(duì)象，而本研究選擇的樣本量大、人群范圍廣，更具代表性，對(duì)深圳地區(qū)異常Hb的篩查和遺傳學(xué)研究具有參考價(jià)值。

異常Hb病表型取決于突變位點(diǎn)是否影響到Hb生物學(xué)功能。一方面，除有明顯功能改變的異常Hb如HbS、HbM和HbE等，多數(shù)異常Hb單純雜合子血液學(xué)表型正常；另一方面，異常Hb合并地貧可表現(xiàn)為貧血，其貧血程度取決于合并的地貧類型，合并靜止型地貧時(shí)，紅細(xì)胞參數(shù)和Hb分析均正常，攜帶者終生可無臨床癥狀；合并輕型地貧時(shí)，紅細(xì)胞參數(shù)降低和/或伴貧血。因此未影響到Hb功能的單純異常Hb雜合子攜帶者與地貧基因攜帶者結(jié)合的夫妻雙方可不需進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

Hb NewYork血液學(xué)表型也符合上述特征。有研究表明，單純Hb NewYork雜合子及合并靜止型α地貧患者紅細(xì)胞參數(shù)指標(biāo)正常；合并輕型α地貧患者紅細(xì)胞參數(shù)降低或有輕度貧血，兩者Hb電泳分析均表現(xiàn)為HbA2正常，異常Hb NewYork變異體含量在40%左右[3，9-10]。Hb NewYork合并輕型β地貧（β0雜合突變），表現(xiàn)為輕、中度小細(xì)胞低色素貧血，無HbA存在，HbA2增高，Hb NewYork含量約占90%[10-11]。由于Hb NewYork合并β0地貧時(shí)，Hb NewYork量與β基因缺陷數(shù)量呈正相關(guān)，β0雜合突變即1個(gè)β基因失活，而剩下1個(gè)β基因發(fā)生突變形成Hb NewYork，因此成人Hb NewYork合并β0地貧無HbA合成，而以Hb NewYork為主，且HbA2升高。β鏈其他異常Hb合并β0地貧的Hb各組分的變化也遵循此規(guī)律，如Hb J-Bangkok及HbE合并β0地貧也無HbA及HbA2升高[12-13]，前者Hb J-Bangkok在90%左右，含量基本同Hb NewYork；但后者HbE含量在50%左右，而HbF升高（40%左右），這是由于HbE屬于地貧樣變異，影響了Hb的功能，使β鏈合成減少，γ-基因重新開放使HbF升高，以降低α和β珠蛋白鏈的不平衡性，使臨床表現(xiàn)減輕，而Hb NewYork和Hb J-Bangkok均為Hb的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，屬于異常Hb病，未影響到Hb的生物學(xué)功能，臨床表型正常。這也提示臨床可以根據(jù)Hb各條帶相對(duì)含量來初步判斷異常Hb的類型，必要時(shí)進(jìn)一步行地貧基因檢測及DNA測序，以明確其是否與地貧相關(guān)，并結(jié)合是否引起異常臨床表現(xiàn)來開展遺傳咨詢工作。

鑒于不同性別血液學(xué)參數(shù)不同，且女性妊娠期存在生理性貧血可能。本研究首先對(duì)成人按性別進(jìn)行Hb NewYork血液學(xué)表型分析，結(jié)果表明成人單純Hb NewYork雜合子及合并靜止型α地貧血液學(xué)表型正常，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[3，9-10]。本研究還發(fā)現(xiàn)1例成人Hb NewYork復(fù)合IVS-Ⅱ-81雜合突變，其血液學(xué)表型正常。β珠蛋白基因IVS-Ⅱ-81（C＞T）突變（HBB：c.315+81C＞T）在HbVar數(shù)據(jù)庫上的記錄顯示發(fā)生于印度人群，可能為中性多態(tài)性位點(diǎn)。我國對(duì)IVS-Ⅱ-81突變位點(diǎn)的報(bào)道較少，李育敏等[8]曾發(fā)現(xiàn)1例Hb Queens合并IVS-Ⅱ-81雜合突變，其血液學(xué)表型表現(xiàn)為正常。這表明IVS-Ⅱ-81雜合突變不影響β珠蛋白基因的表達(dá)，其合并同樣不影響Hb功能的單純異常Hb雜合子時(shí)臨床表型也正常。但由于未進(jìn)行家系調(diào)查，尚不清楚本例攜帶者的Hb NewYork和IVS-Ⅱ-81是否發(fā)生于同一條β鏈上。其次，鑒于不同年齡段的血液學(xué)參數(shù)不同，成人和新生兒Hb NewYork Hb電泳特征存在差異。本研究分析了5例新生兒Hb NewYork雜合子的Hb電泳結(jié)果，其Hb NewYork含量為（4.7±0.6）%。由于臍帶血Hb電泳分析在新生兒地貧篩查中較傳統(tǒng)的紅細(xì)胞脆性試驗(yàn)及血細(xì)胞分析篩查效果更佳[14]，因此本研究提供的臨床資料對(duì)新生兒Hb病的篩查具有重要的參考價(jià)值。

在Hb分析中同一電泳分區(qū)可能存在不同的異常Hb[15]，需通過DNA測序才能鑒定其類型，因此臨床應(yīng)注意區(qū)別各異常Hb，重視異常Hb及其合并地貧時(shí)的表型與基因型的相關(guān)規(guī)律，以更好地進(jìn)行Hb病的篩查、診斷和遺傳咨詢。