易翠興，李東至，袁思敏，李發(fā)濤，李偉，廖燦

廣州市婦女兒童醫(yī)療中心產(chǎn)前診斷中心，廣東 廣州 510623

人類最常見的染色體異常是非整倍體異常，占所有懷孕孕婦的5%，其也是導致流產(chǎn)的主要原因。染色體數(shù)目異常和結構性異常占新生兒的1/200，是導致發(fā)育障礙和先天性疾病的常見原因[1-3]。在大多數(shù)國家，細胞遺傳學分析已成為產(chǎn)前診斷的重要組成部分。自細胞遺傳學研究開始發(fā)展，傳統(tǒng)的染色體核型分析已被作為產(chǎn)前診斷的金標準[4]，其準確性約為99%，但這種技術費力且培養(yǎng)時間較長，導致報告時間較長。對于大多數(shù)細胞遺傳學實驗室而言，結果可能需要15～20 d，這對于焦慮的父母來說是一個漫長的等待。

熒光定量聚合酶鏈反應(fluorescence quantitative polymerase chain reaction，QF-PCR) 技術是采用多重PCR 擴增和毛細管電泳分離技術，通過定性、定量分析短串聯(lián)重復序列(short tandem repeat，STR) 遺傳標記的多態(tài)性，診斷常見染色體非整倍體[5-8]。本研究應用QF-PCR 技術聯(lián)合傳統(tǒng)染色體核型分析技術對產(chǎn)前診斷羊水標本進行詳細檢測，探討兩種技術聯(lián)合分析在檢測染色體異常中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年1月至2018年12月在廣州市婦女兒童醫(yī)療中心產(chǎn)前診斷中心進行羊水產(chǎn)前診斷的16 314 例孕婦病例資料，孕婦孕周14～35周，平均(19.2±2.5)周；孕婦16～51 歲，平均(32.3±5.7)歲。其中2011—2014 年孕婦平均年齡(31.4±5.7)歲，平均孕周(19.2±3.3)周；2015—2018 年孕婦平均年齡(33.4±5.6)歲，平均孕周(18.6±2.9)周。進行羊水穿刺的孕婦均無手術所列的相關禁忌證，而且每例患者均在充分的溝通及風險告知后，簽署相關的知情同意書和在本院建立產(chǎn)前診斷病歷并簽字確認。

1.2 染色體核型分析 在B 超監(jiān)護下按照產(chǎn)前診斷手術規(guī)范嚴格進行無菌操作，經(jīng)腹壁行羊膜腔穿刺術，用注射器抽取羊水18～20 mL 分別置于2 支15 mL 無菌離心管中并立即送檢。1 600 r/min 離心10 min，在超凈工作臺內棄上清液并各留取2 mL 沉淀，分別接種于兩個盛有5 mL 羊水培養(yǎng)基的25 cm2Nunc培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶分別置入兩個37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，6～8 d后在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)瓶中羊水細胞生長情況，如果發(fā)現(xiàn)其中有8～10個較密集的克隆貼壁生長后即可換液，換液后繼續(xù)放入二氧化碳培養(yǎng)箱中，1～2 d后觀察直到發(fā)現(xiàn)細胞島上有較多圓形或雙圓形透亮細胞覆蓋，加濃度20 μg/mL的秋水仙素后作用2 h 后即可收獲細胞。經(jīng)過低滲、預固定、固定、制片、80℃烤片2 h、G 顯帶和全自動核型掃描系統(tǒng)掃片等多個環(huán)節(jié)，每個病例核型計數(shù)≥20個，分析≥5個核型，異常核型加大計數(shù)和分析，核型描述按《人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN 2016)》命名。

1.3 QF-PCR檢測

1.3.1 QF-PCR 檢測位點 應用QF-PCR 方法檢測21、18、13 及性染色體上的STR 共24 個位點，其中21號染色體7個STR位點，18號染色體5個STR位點，13號染色體5個STR位點，性染色體7個STR位點。

1.3.2 QF-PCR 檢 測 步 驟 (1) DNA 提 ?。篋NA 提取按照QIAGEN 公司試劑盒說明步驟進行。(2)PCR 擴增：擴增體系分為三組，PCR擴增體積25 μL，1 X buffer，2 mmol/L MgCl2，引物10～40 pmol，Taq DNA聚合酶0.6 U，95℃5 min；隨后變性95℃30 s，退火60℃40 s，延伸72℃50 s，共26個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。(3)毛細管電泳：取1 μL PCR 反應產(chǎn)物與10 μL 上樣液(包括9.5 μL 甲酰胺及0.5 μL 分子內標)混合，95℃變性2 min，用ABI3100 遺傳分析儀進行毛細管電泳。(4)結果分析及判斷：用Gene Mapper 3.7 軟件進行結果分析。雙峰面積比率0.8～1.4 為正常二倍體；當雙峰面積比率＜0.65或>1.8時，提示三體。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0 統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料比較采用R×C χ2檢驗，配對χ2檢驗，Kappa一致性檢驗，kappa值分為五組表示不同級別的一致性：0.0～0.20 極低的一致性、0.21～0.40 一般的一致性、0.41～0.60 中等的一致性、0.61～0.80 高度的一致性和0.81～1 幾乎完全一致，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同年度各年齡組孕婦羊水產(chǎn)前診斷核型結果比較 2011—2014 年35 歲以上孕婦進行羊水產(chǎn)前診斷異常率為5.41%，2015—2018年35歲以上孕婦進行羊水產(chǎn)前診斷異常率11.89%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=74.688，P=0.001)。2011—2014 年不同年齡組孕婦羊水染色體核型異常率比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=4.396，P=0.355)；2015—2018 年不同年齡組孕婦間羊水染色體核型異常率比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=33.492，P=0.001)。各個年齡組在兩個年度間的異常率比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 不同年度各年齡組孕婦羊水產(chǎn)前診斷核型結果比較

2.2 不同年度不同孕周孕婦羊水產(chǎn)前診斷核型結果比較 羊水產(chǎn)前診斷主要集中在孕16～23 周，其中2011—2014 年產(chǎn)前診斷8 225 例，異常412 例，異常率為5.01%；2015—2018年產(chǎn)前診斷6 732例，異常681例，異常率為10.12%，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=142.529，P=0.001)。2011—2014年不同孕周孕婦之間羊水染色體核型異常率比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.562，P=0.967)；2015—2018 年不同孕周孕婦之間羊水染色體核型異常率比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=18.432，P=0.001)。除孕周≥28 周組以外，其余各組在兩個年度間的異常率比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 不同年度不同孕周孕婦羊水產(chǎn)前診斷核型結果比較

2.3 兩種方法篩查13、18、21、性染色體異常比較 2011—2014 年QF-PCR 篩查出21 三體133 例，18三體40例，13三體4例，性染色體異常28例，而核型結果在21、18、13的診斷與之完全吻合，且性染色體異常多發(fā)現(xiàn)1 例嵌合體，符合率為99.91%；2015—2018 年篩查出21 三體374 例，18 三體92 例，13 三體19 例，性染色體異常99 例，而核型結果在21、18、13 的診斷與之完全吻合，且性染色體異常多發(fā)現(xiàn)4例嵌合體，符合率為99.32%。

2.4 QF-PCR與核型結果一致性分析 2011—2014年核型結果判斷異常456例，QF-PCR檢測篩查陽性205例；2015—2018年核型結果判斷異常752 例，QF-PCR檢測篩查陽性584 例。經(jīng)配對χ2檢驗，2011—2014 年兩種方法比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=3 972.869，P=0.000)，Kappa 一致性檢驗(Kappa=0.608，P=0.000)，一致性中等；2015—2018年兩種方法比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=546 5.071，P＜0.05)，Kappa 一致性檢驗(Kappa=0.862，P=0.000)，一致性好。

3 討論

染色體異常引起的遺傳性疾病會導致超過50%的自然流產(chǎn)、死產(chǎn)和過早死亡。染色體異常包括數(shù)目異常和結構異常，其中染色體非整倍性異常被證明是人類最常見的染色體畸變之一，嚴重威脅著人類健康。最常見的染色體數(shù)目異常包括唐氏綜合征(21三體)、愛德華氏綜合征(18三體)、Patau綜合征(13三體)、特納綜合征(45，X)、克氏綜合征(47，XXY)和三倍體等，它們占染色體異常的80%以上[9-11]。染色體異常引起的遺傳病給社會和家庭造成沉重的精神和經(jīng)濟負擔，目前尚無法有效治愈，唯一可行的方法是通過產(chǎn)前篩查或產(chǎn)前診斷來減少和避免此類患兒的出生。因此，對染色體疾病進行產(chǎn)前診斷及其診斷方法尤為重要。

本研究顯示，羊水產(chǎn)前診斷主要集中在16～23 孕周，這與羊水取材的最佳時間相吻合，其中2011—2014年產(chǎn)前診斷8 225 例，異常數(shù)412 例，2015—2018 年產(chǎn)前診斷6 732 例，異常數(shù)681 例，異常率由原來的5.01%上升為10.12%，35 歲以上進行羊水產(chǎn)前診斷核型異常率2011—2014年為5.41%，而2015—2018年增長為11.89%，同時各年齡組不同年度間異常率比較2015—2018 年顯著高于2011—2014 年。出現(xiàn)以上檢出差異說明隨著產(chǎn)前診斷技術管理規(guī)范越來越細化，產(chǎn)前診斷質量控制要求越來越高，醫(yī)生對產(chǎn)前診斷指征把握地越來越準確，以及近年來無創(chuàng)產(chǎn)前篩查技術的應用，雖然產(chǎn)前診斷的孕婦人數(shù)在減少，但陽性檢出率提高了，致使異常率增加，故2015—2018 年異常率顯著高于2011—2014 年，因此，隨著醫(yī)療技術的發(fā)展，染色體異常檢出率提高，有效的防止了出生缺陷的發(fā)生。

染色體核型分析技術作為產(chǎn)前診斷的金標準，能夠檢出23對染色體數(shù)目異常和主要結構異常，但因其檢測時間長，一般報告周期為21 d 左右，且存在細胞培養(yǎng)失敗的風險，亟需新的技術能夠彌補其不足。近年來，QF-PCR 用于檢測常見染色體非整倍體異常已被眾多產(chǎn)前診斷中心廣泛應用。本研究基于羊水樣本QF-PCR 技術快速分析檢測13、18、21，X 和Y 五條染色體的數(shù)目異常，結果顯示QF-PCR 和傳統(tǒng)核型對比，兩個時間段對于常見的五條染色體非整倍體異常的符合率均在99%以上。QF-PCR與傳統(tǒng)G 顯帶核型分析相比更高效，其操作簡便，不需要細胞培養(yǎng)，一般報告周期為2～3 d，快的可以達到24 h 左右出結果，可以極大地縮短常見染色體非整倍體報告所需要的時間，可緩解孕婦及家屬的焦慮情緒。而傳統(tǒng)的核型分析技術發(fā)報告時間在15～21 d，且存在細胞培養(yǎng)失敗的風險。

本研究同時發(fā)現(xiàn)，2011—2014年核型結果判斷異常456 例，QF-PCR 檢測判斷陽性結果205 例；2015—2018 年核型結果判斷異常752 例，QF-PCR 檢測判斷陽性結果584例。兩種方法采用kappa一致性分析，結果顯示它們之間具有較高一致性。但同時也說明QF-PCR技術也有一定的局限性，它無法檢測出結構異常和其他染色體非整倍體異常，正好傳統(tǒng)的核型分析能夠彌補其不足，從而保證產(chǎn)前診斷結果的準確性。

總之，每種方法單一應用均存在各自的不足，所以目前QF-PCR 技術聯(lián)合傳統(tǒng)染色體核型分析進行羊水產(chǎn)前診斷，不僅可以為孕婦提供快速準確的常見的五條染色體非整倍體檢測結果，減輕孕婦在等待核型確診結果時漫長的焦慮和緊張，同時傳統(tǒng)染色體核型分析技術作為細胞遺傳學的金標準，仍然發(fā)揮著它的巨大作用，為臨床提供結構異常和其他非整倍體異常的檢測結果，而且該技術可以診斷低比例嵌合體。兩種方法的聯(lián)合應用實現(xiàn)了優(yōu)勢互補，有效的避免了出生缺陷的發(fā)生，在產(chǎn)前診斷的診治方面發(fā)揮著重要的價值。