趙志龍，雷建衛(wèi)，張麗芳

1.寶雞市中心醫(yī)院腫瘤外科，陜西 寶雞 721000；2.寶雞市中醫(yī)醫(yī)院病理科，陜西 寶雞 721000

結(jié)腸癌是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率在所有消化道惡性腫瘤中排名第三[1]，近年來(lái)隨著人類(lèi)生活水平的提高以及飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)腸癌發(fā)病率仍然有一定程度的上升[2-3]。目前針對(duì)結(jié)腸癌的分子靶向治療在臨床應(yīng)用中取得了很大的療效，但仍然有部分患者在初診時(shí)即已經(jīng)發(fā)生了局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，使后續(xù)的治療更加棘手[4]。鞘氨醇激酶1(SPHK1)是鞘磷脂的活性代謝產(chǎn)物1-磷酸鞘氨醇在體內(nèi)合成過(guò)程中的一個(gè)限速酶，參與體內(nèi)的炎癥反應(yīng)、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過(guò)程[5-7]，最近大量的研究提示SPHK1與多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡以及遷移過(guò)程密切相關(guān)[8-9]。基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)在腫瘤中發(fā)揮的作用目前較為明確，它可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[10-11]。SPHK1 和腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的相關(guān)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其可能通過(guò)MMP2 發(fā)揮作用，因此本研究擬通過(guò)免疫組化檢測(cè)SPHK1 蛋白與MMP2 蛋白在人結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況，初步探討SPHK1 蛋白與結(jié)腸癌組織的關(guān)系，為進(jìn)一步的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)提供一定的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集寶雞市中心醫(yī)院2014 年1月至2018 年12 月期間收治的結(jié)腸癌患者石蠟標(biāo)本，共計(jì)201 例，所有患者均經(jīng)病理學(xué)確診結(jié)腸癌，術(shù)前均無(wú)放化療以及免疫相關(guān)治療史。其中男性109 例，女性92 例；年齡35～78 歲，平均62 歲；右半結(jié)腸癌109 例，左半結(jié)腸癌92 例。根據(jù)AJCC TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)(2017 年第8 版)對(duì)結(jié)腸癌進(jìn)行分期，其中淋巴結(jié)陽(yáng)性者112 例，淋巴結(jié)陰性者89 例；腫瘤T 分期中，T123 例，T232 例，T382 例，T474 例；組織學(xué)分化中：高分化66 例，中低分化135 例。同時(shí)以距腫瘤組織邊緣5 cm 為界限，取癌旁組織201 例，排除其中仍然有腫瘤細(xì)胞或非典型細(xì)胞后剩余156 例，鏡下未見(jiàn)明確腫瘤細(xì)胞且無(wú)炎癥、增生等病變。

1.2 方法 標(biāo)本術(shù)后30 min 內(nèi)置入甲醛溶液中固定24 h 再進(jìn)行石蠟包埋并制備病理切片，使用免疫組化SP 法檢測(cè)并進(jìn)行染色，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行二甲苯脫蠟、無(wú)水酒精水化、3%H2O2阻斷、檸檬酸緩沖液抗原修復(fù)、一抗過(guò)夜后第二日加二抗、DAB 染色、制片。兔抗人多克隆抗體SPHK1 (bs-2652R)與MMP2 (bs-0412R)分別購(gòu)自北京博奧森生物有限公司，抗體稀釋濃度分別為1∶200和1∶300。采用磷酸鹽緩沖液(PBS)作為陰性對(duì)照。SP 試劑盒與DAB 顯色劑均購(gòu)自中山金橋生物公司。

1.3 結(jié)果判定 染色強(qiáng)度的判定標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)參考文獻(xiàn)[12-13]，由兩位高年資病理醫(yī)師讀片分析，以鏡下在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)發(fā)現(xiàn)黃色顆粒定義為蛋白表達(dá)陽(yáng)性，隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野，按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分為四個(gè)級(jí)別評(píng)分，0%～24%、25%～49%、50%～74%、>75%分別評(píng)分為1 分、2 分、3 分、4 分。以染色強(qiáng)度評(píng)分為三個(gè)等級(jí)：細(xì)胞未著色為0分，棕黃色1分，褐色為2分。結(jié)果最終得分的判定標(biāo)準(zhǔn)為著色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)乘以陽(yáng)性細(xì)胞百分比的分?jǐn)?shù)，最終得分：0 分為陰性，1～3 分為低表達(dá)，4～8分為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，SPHK1 與MMP2 蛋白表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman 等級(jí)相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SPHK1 蛋白和MMP2 蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況 所有標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色后發(fā)現(xiàn)SPHK1 與MMP2 蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中(圖1)。SPHK1 蛋白和MMP2 蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)率分別為54.7%、64.7%，明顯高于癌旁組織中的39.7%、24.4%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 SPHK1 與MMP2 在人結(jié)腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平比較[例(%)]

2.2 SPHK1 和MMP2 蛋白的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 SPHK1 蛋白在人結(jié)腸癌組織中的表達(dá)主要與患者的淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分化程度、T 分期以及血管是否侵犯有關(guān)(P＜0.05)。MMP2 蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)與患者淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移，T 分期、M分期以及血管侵犯有關(guān)(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

圖1 SPHK1與MMP2在人結(jié)腸癌組織與癌旁組織中的表達(dá)

表2 SPHK1和MMP2的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

2.3 結(jié)腸癌組織中SPHK1 與MMP2 表達(dá)的關(guān)系 經(jīng)Spearman 秩相關(guān)性分析顯示，SPHK1 蛋白與MMP2蛋白在表達(dá)量之間呈正相關(guān)(r=0.352，P＜0.05)，見(jiàn)表3。

表3 SPHK1與MMP2蛋白在人結(jié)腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性(例)

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)脂類(lèi)代謝在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用[14]。絲氨酸(Cer)、鞘氨醇(Sph)以及鞘氨醇1-磷酸(S1P)在體內(nèi)脂質(zhì)代謝過(guò)程中保持動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)平衡傾向于Cer和Sph時(shí)，細(xì)胞開(kāi)始進(jìn)入程序性死亡過(guò)程，當(dāng)平衡傾向于S1P 時(shí)細(xì)胞會(huì)繼續(xù)生存并持續(xù)增殖[15]。研究發(fā)現(xiàn)SPHK1蛋白可將Sph磷酸化為S1P，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖與遷移[16]。

SPHK 家族中共有7 個(gè)成員，SPHK1 為鞘磷脂的活性代謝產(chǎn)物1-磷酸鞘氨醇(S1P)生物合成過(guò)程中的限速酶，參與到體內(nèi)磷脂的代謝過(guò)程，其主要分布在人體的脾臟、腦組織、胸腺細(xì)胞中[17-18]。然而最近幾年腫瘤界學(xué)者對(duì)其深入研究后發(fā)現(xiàn)SPHK1 蛋白在人類(lèi)多種惡性腫瘤細(xì)胞或組織中均有不同程度的表達(dá)，扮演著癌基因的角色。研究發(fā)現(xiàn)SPHK1 可促進(jìn)腫瘤血管的生成、提高腫瘤的增殖活性、抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[19]。我國(guó)學(xué)者鄭曉東[20]在研究乳腺癌過(guò)程中發(fā)現(xiàn)SPHK1 蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織，且其高表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換有關(guān)；使用siRNA 沉默SPHK1基因后對(duì)其侵襲與遷移能力進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的侵襲與遷徙能力明顯下降，提示SPHK1可能參與到乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過(guò)程中。在胃癌中他們同樣發(fā)現(xiàn)SPHK1蛋白高表達(dá)，而癌旁組織中很少或者幾乎不表達(dá)，SPHK1 蛋白在胃癌組織中的高表達(dá)與腫瘤的T分期、N分期以及是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，這與我們的研究結(jié)果較為類(lèi)似。關(guān)于SPHK1 在結(jié)腸癌組織與細(xì)胞中的表達(dá)亦有少量研究，SPHK1在結(jié)腸癌組織中同樣過(guò)度表達(dá)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝臟轉(zhuǎn)移以及較晚的TNM分期有關(guān)[21]。

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的特征，一般要經(jīng)過(guò)以下過(guò)程：原發(fā)腫瘤細(xì)胞穿過(guò)基底膜與血管，進(jìn)入血液，隨血流到達(dá)全身各個(gè)器官，再通過(guò)血管進(jìn)入其他組織器官進(jìn)而增殖。因此癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的第一個(gè)條件就是細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而為惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移提供先決條件。目前大量的研究已經(jīng)證實(shí)基質(zhì)金屬蛋白水解酶家族(MMPs)中的MMP2 在上述過(guò)程中扮演著極其重要的角色[22]。

BAO等[23]在肝癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，無(wú)論通過(guò)何種辦法只要阻斷SPHK1蛋白的生成，就可以使肝癌細(xì)胞侵襲以及遷移能力下降，另外在其他腫瘤細(xì)胞株中的研究也發(fā)現(xiàn)了SPHK1 蛋白可以參與到腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移過(guò)程[24-25]。通過(guò)文獻(xiàn)回顧后發(fā)現(xiàn)了一條SPHK1-S1P-ERK-VEGF相互作用的通路[26]，SPHK1將細(xì)胞膜上的Sph 磷酸化生成S1P，S1P 被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，然后與其特異性受體相互偶聯(lián)，激活細(xì)胞內(nèi)的G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路，ERK蛋白在該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中負(fù)責(zé)將信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，在此過(guò)程中有NF-κB、MMP以及VEGF等分子的轉(zhuǎn)錄與活化參與，從而引起細(xì)胞的增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移[27-28]。

LIU等[29]團(tuán)隊(duì)在結(jié)直腸癌組織與細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)，SPHK1 蛋白可以激活ERK1/2 通路從而增加MMP2/9蛋白的表達(dá)，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲與遷徙，提示ERK1/2 信號(hào)通路的異常激活，可能促使結(jié)腸癌細(xì)胞向更加惡性的階段進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示人結(jié)腸癌組織中SPHK1的陽(yáng)性表達(dá)明顯高于癌旁組織，且SPHK1蛋白的表達(dá)與結(jié)腸癌患者的T分期、N分期、組織學(xué)分化程度以及是否血管侵犯有關(guān)，而與性別、年齡和腫瘤位置等因素?zé)o關(guān)。

LONG 等[30]研究了85 例結(jié)腸癌組織中SPHK1 蛋白的表達(dá)情況后發(fā)現(xiàn)，使用siRNA沉默SPHK1的表達(dá)后，結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖活性明顯受到抑制，與此同時(shí)E-鈣黏素蛋白的表達(dá)是增加的，此時(shí)EMT發(fā)生逆轉(zhuǎn)，導(dǎo)致其侵襲和遷移能力下降。敲除SPHK1 基因的結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲與遷移能力明顯下降，細(xì)胞內(nèi)MMP2蛋白的表達(dá)量也發(fā)生不同程度的下降[29]。因此推測(cè)SPHK1 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲與遷徙能力的影響可能與MMP2 蛋白的合成與表達(dá)有關(guān)。本研究通過(guò)對(duì)結(jié)腸癌組織標(biāo)本中的SPHK1 蛋白的表達(dá)與MMP2 蛋白表達(dá)進(jìn)行相關(guān)分析后發(fā)現(xiàn)兩者呈正相關(guān)。因此可以猜測(cè)SPHK1 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力的影響可能是通過(guò)MMP2發(fā)生作用。

綜上所述，SPHK1蛋白與MMP2蛋白在人結(jié)腸癌組織中的表達(dá)量是增高的，而且兩者的表達(dá)具有一定的協(xié)同關(guān)系，這也暗示著SPHK1在人結(jié)腸癌組織中可能是通過(guò)MMP2起作用的，而有其他腫瘤細(xì)胞學(xué)研究提示MMP2可能是SPHK1蛋白的下游分子，但在結(jié)腸癌組織中的精確機(jī)制尚未明了。因而，隨后的研究可能更多的會(huì)集中在SPHK1 上下游分子的尋找方面以及相關(guān)作用機(jī)制方面的研究。