張 星， 崔向偉， 李宗霖， 李志敏

（華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

谷胱甘肽（Glutathione，GSH）是由L-谷氨酸（LGlu）、L-半胱氨酸（L-Cys）和甘氨酸（Gly）通過肽鍵連接而成的活性巰基化合物。GSH 在生物體內(nèi)具有抗氧化、保護(hù)細(xì)胞和解毒等功能[1]。作為藥物、食品和化妝品添加劑，GSH 也廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和輕工領(lǐng)域[2-3]。目前，GSH 的生產(chǎn)方法主要包括化學(xué)法和生物法。生物法合成GSH 具有反應(yīng)條件溫和、成本低以及環(huán)境污染少等優(yōu)點(diǎn)。生物法又可分為發(fā)酵法和酶法。發(fā)酵法生產(chǎn)GSH 存在著底物和產(chǎn)物降解，副產(chǎn)物競爭和下游分離困難等缺點(diǎn)，因而GSH 的生產(chǎn)效率不高[4]。相比于發(fā)酵法，酶法生產(chǎn)體系因?yàn)榻M分簡單，底物與酶更易接觸，具有周期短、易操作和得率高等優(yōu)點(diǎn)[5]。

GSH 的生物合成途徑是通過兩步依賴腺苷三磷酸（ATP）的反應(yīng)合成，首先，L-Glu 和L-Cys 由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化，生成二肽γ-谷氨酰半胱氨酸，再經(jīng)GSH 合成酶催化，在γ-谷氨酰半胱氨酸的C 端殘基加上甘氨酸形成GSH[6]。谷胱甘肽雙功能合成酶(GshF)是近年來發(fā)現(xiàn)的新型酶，在ATP 和Mg2+或Mn2+存在下，具有可以同時(shí)催化GSH 兩步反應(yīng)的活性[7-8]，這極大地推進(jìn)了GSH 生物合成的研究進(jìn)展。酶法生產(chǎn)GSH，一般需要在體系中直接添加價(jià)格昂貴的ATP，使得生產(chǎn)成本大大增加，限制了酶法生產(chǎn)的大規(guī)模應(yīng)用。多聚磷酸激酶（PPK）是可以用于ATP 再生的一種激酶，利用底物多聚磷酸（polyP）和腺苷二磷酸（ADP）可以催化合成ATP[9]。底物polyP 因?yàn)閮r(jià)格低廉，性質(zhì)穩(wěn)定，在ATP 依賴的反應(yīng)中得到了廣泛應(yīng)用[10-11]。

本文利用PPK 和GshF 純酶建立級聯(lián)反應(yīng)，利用polyP 代替GSH 合成反應(yīng)中需要添加的ATP，酶法合成了GSH；同時(shí)對酶的表達(dá)條件、系統(tǒng)反應(yīng)條件包括底物濃度、溫度和酶比例等優(yōu)化后，達(dá)到了酶法高效生產(chǎn)GSH 的目的。

1 材料和方法

1.1 菌株與試劑

來源于菌株Thermosynechococcus elongates 的PPK和Streptococcus sanguinis 的GshF 的重組質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室之前工作構(gòu)建，并保存于大腸桿菌Rosetta2（DE3）中[12]。ADP、GSH 和polyP 購自美國Sigma-Aldrich 公司，蛋白胨和酵母粉購自英國OXOID 公司，其他試劑均購自上海麥克林生化科技有限公司。試劑純度為分析純或更高純度。

1.2 蛋白表達(dá)條件優(yōu)化

取含有表達(dá)質(zhì)粒的菌株，按2%接種量接入3 mL含50 mg/L 卡那霉素的Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基中，在37 ℃、220 r/min 條件下培養(yǎng)7 h，然后轉(zhuǎn)接至50 mL LB 培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6～0.8 之間，加入終濃度為0.2 mmol/L 異丙基-β-d-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)，再轉(zhuǎn)入不同溫度（18 ℃和37 ℃）培養(yǎng)至OD600為3～4。取500 μL（OD600約為3）培養(yǎng)的菌體于12 000 r/min，4 ℃條件下離心10 min，用20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0，含250 mmol/L NaCl）洗滌1 次后，重懸于500 μL 上述緩沖液，冰水浴中超聲破碎（功率200 W，工作2 s 停4 s，90 個循環(huán)）。最后將破碎細(xì)胞液于12 000 r/min、4 ℃下離心20 min，取上清和沉淀進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)，分析蛋白表達(dá)情況。

1.3 蛋白純化

將最優(yōu)誘導(dǎo)表達(dá)條件下的細(xì)胞收集破碎后，在8 000 r/min、4 ℃離心30 min，得到含有重組蛋白的上清液，利用Ni-NTA 柱對蛋白進(jìn)行親和層析純化。用含有10～300 mmol/L 咪唑的緩沖液梯度洗脫吸附在柱上的蛋白，SDS-PAGE 檢測各個梯度的蛋白洗脫純度，收集純度較高的蛋白洗脫液，離心濃縮后加入0.20～0.25 g/mL 的甘油置于?80 ℃保存。

1.4 GSH 合成體系的反應(yīng)條件優(yōu)化

利用純酶PPK 和GshF 構(gòu)建GSH 合成體系。標(biāo)準(zhǔn)體系組成（500 μL）：200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)，50 mmol/L L-Glu，50 mmol/L Gly，50 mmol/L L-Cys，40 mmol/L MgCl2，1 g/L PPK，1 g/L SS（Somatostatin），2 mmol/L DTT (D, L-Dithiothreitol)，2 mmol/L ADP，20 mmol/L polyP，45 ℃反應(yīng)。按不同時(shí)間間隔取樣50 μL，加入三氯乙酸（終質(zhì)量濃度0.1 g/mL）終止反應(yīng)，離心取上清利用HPLC 測定GSH 濃度。反應(yīng)條件優(yōu)化如下：在反應(yīng)體系中加入不同濃度比（20∶40，20∶60，30∶60，30∶45，30∶90）的polyP 與MgCl2；在反應(yīng)體系中添加不同濃度（0.5～4 mmol/L）的ADP；初始pH 8.0 時(shí)，考察不同溫度（30～50 ℃）對反應(yīng)的影響；當(dāng)氨基酸底物濃度為120 mmol/L，SS 質(zhì)量濃度為1 g/L 時(shí)，考察不同PPK 質(zhì)量濃度（2～4 g/L）對反應(yīng)的影響。

1.5 分析方法

細(xì)胞密度采用紫外-可見分光光度計(jì)在600 nm下檢測樣品吸光度值。蛋白濃度利用購自北京天根生化科技有限公司的BCA 試劑盒測定。GSH 利用高效液相色譜檢測：色譜柱為日本島津公司的Wondasil C18 柱(4.6 mm × 150 mm)，流動相A 為50 mmol/L KH2PO4與10 mmol/L 1-庚烷磺酸鈉混合液(磷酸調(diào)節(jié)pH 3.0)，流動相B 為純甲醇，流動相A 和流動相B 的體積比為95∶5，柱溫30 ℃，紫外檢測波長210 nm，流速0.6 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度對蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的影響

誘導(dǎo)溫度對蛋白表達(dá)有著重要的影響，溫度過高會使蛋白翻譯較快，錯誤折疊率加大，容易生成包涵體，導(dǎo)致蛋白失活。GshF 在不同溫度下誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE 分析如圖1（a）所示，在37 ℃和18 ℃的細(xì)胞破碎上清液中都可看到GshF 的可溶表達(dá)，但在37 ℃的裂解液沉淀中可以明顯觀察到有部分不可溶蛋白，說明GshF 在高溫誘導(dǎo)時(shí)會形成少量包涵體。PPK 在不同溫度下的誘導(dǎo)如圖1（b）所示，在37 ℃和18 ℃誘導(dǎo)時(shí)都會形成較多的沉淀，但37 ℃表達(dá)時(shí)蛋白大部分都在沉淀中，上清液中幾乎觀察不到可溶蛋白，而在18 ℃表達(dá)條件下的上清液中可以觀察到有可溶表達(dá)。說明PPK 在低溫條件下也容易產(chǎn)生可溶表達(dá)，因?yàn)榈蜏乇磉_(dá)時(shí)，蛋白翻譯折疊較慢，易于可溶蛋白的生成。

圖 1 誘導(dǎo)溫度對（a）GshF 和（b）PPK 表達(dá)的影響Fig. 1 Effect of induced temperatures on the expression of(a) GshF and (b) PPK

2.2 蛋白純化

由于表達(dá)的GshF 和PPK 都帶有組氨酸標(biāo)簽，因此可以通過鎳離子柱親和層析純化。將18 ℃誘導(dǎo)后破碎的細(xì)胞上清液過柱洗脫后，得到GshF 和PPK 的純酶液。利用SDS-PAGE 檢測，電泳條帶如圖2 所示。得到的蛋白條帶均一，大小都在90 ku 左右，與根據(jù)氨基酸序列推算的理論值一致。

圖 2 GshF 和PPK 的純化Fig. 2 Purification of GshF and PPK

2.3 GSH 合成反應(yīng)條件優(yōu)化

GshF 和PPK 合成GSH 的原理如圖3 所示，GshF可以利用L-Glu，L-Cys 和Gly 合成GshF，這是一個耗能反應(yīng)，需要ATP 參與供能。傳統(tǒng)的酶法催化需要直接加入ATP，極大地增加了生產(chǎn)成本，不利于大規(guī)模的生產(chǎn)。polyP 作為能量供體，可以由PPK 催化斷裂磷酸酐鍵，降解的磷酸基團(tuán)結(jié)合ADP 生成ATP。當(dāng)引入PPK 催化的反應(yīng)時(shí)，在體系中初始加入一定量的polyP 和少量的ADP，即可達(dá)到代替GSH 合成反應(yīng)中需要添加的ATP 的目的，讓ATP 和ADP 在體系中循環(huán)再生、高效合成GSH。

圖 3 GshF 和PPK 偶聯(lián)合成GSHFig. 3 GSH synthesis by coupling GshF and PPK

2.3.1 PolyP 和MgCl2的濃度比例的優(yōu)化 PolyP 作為能量供體，在體系內(nèi)不斷地被消耗，因此polyP 的供給會直接影響到ATP 的生成量，從而影響GSH 的合成效率。但是高濃度的polyP 會和MgCl2發(fā)生螯合反應(yīng)，從而導(dǎo)致polyP 的損失，同時(shí)GshF 和PPK為MgCl2依賴的酶，Mg2+濃度的降低也會影響GshF和PPK 的活性，因此合適比例的polyP 和MgCl2對反應(yīng)效率有著重要影響。如圖4 所示，當(dāng)polyP濃度為20 mmol/L，MgCl2濃度分別為40 mmol/L 和60 mmol/L 時(shí)，60 mmol/L 的MgCl2對體系產(chǎn)生了抑制作用。當(dāng)polyP 濃度提高到30 mmol/L，MgCl2濃度分別為45、60 和90 mmol/L 時(shí)，MgCl2濃度越高，GSH 生產(chǎn)效率也越低?？梢钥闯?，當(dāng)polyP 濃度一定時(shí)，MgCl2濃度越高，對反應(yīng)的抑制效果越明顯。實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，高濃度的polyP 和MgCl2會形成白色沉淀。這些結(jié)果說明，過高的MgCl2濃度會引起MgCl2與polyP 的螯合反應(yīng)，降低GSH 的生產(chǎn)效率。當(dāng)MgCl2濃度都為60 mmol/L 時(shí)，加入30 mmol/L polyP的體系生產(chǎn)效率比20 mmol/L polyP 的體系提高約50%，因?yàn)?0 mmol/L polyP 時(shí)，增加了螯合后剩余的polyP 的有效濃度。當(dāng)polyP 和MgCl2的濃度比為30 : 45 時(shí)，反應(yīng)效率最高。這些結(jié)果說明了合適的polyP 和MgCl2的濃度比確實(shí)會對催化效率起重要作用。

圖 4 不同polyP/MgCl2 濃度比對GSH 合成的影響Fig. 4 Effect of the concentration ratio of polyP to MgCl2 on the synthesis of GSH

2.3.2 初始ADP 濃度優(yōu)化 ADP 是雙酶反應(yīng)體系中的關(guān)鍵輔因子，在兩個反應(yīng)之間起到橋梁作用。因此ADP 濃度可能會對反應(yīng)體系的催化效率產(chǎn)生較大影響。ADP 也是反應(yīng)底物中成本較高的底物之一，過多的ADP 會增加系統(tǒng)的成本，不利于GSH 反應(yīng)的大規(guī)模應(yīng)用。因此，ADP 的初始濃度直接關(guān)系到GSH 合成的催化效率和生產(chǎn)成本。對初始的ADP 濃度進(jìn)行優(yōu)化，不同ADP 濃度對GSH合成的影響結(jié)果如圖5 所示。初始ADP 濃度從0.5 mmol/L 增加到4.0 mmol/L，GSH 的濃度逐漸下降，2.0 h 時(shí)GSH 的濃度從15.4 mmol/L 降到4.3 mmol/L，說明在此范圍內(nèi)，當(dāng)ADP 濃度為0.5 mmol/L 時(shí)，反應(yīng)的催化效率最高。底物ADP 濃度增加，GSH 生產(chǎn)效率反而降低，說明過高的ADP 濃度對GshF 和PPK 兩酶偶聯(lián)催化起到抑制作用，原因可能是ADP 和polyP 的催化通道在PPK 結(jié)構(gòu)上較近，因?yàn)锳DP 比長鏈的polyP 柔性較強(qiáng)，過多的ADP 會聚集在polyP 的催化通道入口，從而降低了polyP 被催化的活性[13]。

圖 5 不同ADP 濃度對GSH 合成的影響Fig. 5 Effect of the concentration of ADP on the synthesis of GSH

圖 6 溫度對GSH 合成的影響Fig. 6 Effect of temperature on the synthesis of GSH

2.3.3 溫度優(yōu)化 溫度對酶反應(yīng)催化有著重要影響，一定范圍內(nèi)，溫度升高可以提高酶活性，從而增加催化速率。對游離酶體系的溫度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖6 所示，在0.5 h 內(nèi)，50 ℃溫度下GSH 合成速率最快，GSH 濃度達(dá)到23 mmol/L。PPK 是來源于嗜熱菌的酶，溫度升高，可以加快ATP 的生成速率，從而提高GSH 的合成速率。在30 ℃條件下，GSH 的合成速率最慢。因?yàn)镻PK 在低溫下酶活性相對較低，同時(shí)根據(jù)本課題組研究，30 ℃時(shí)GshF 酶活也會下降[12]。在37～45 ℃范圍內(nèi)，GSH 的生產(chǎn)效率隨著溫度升高而升高。其中，在45 ℃條件下，2 h 反應(yīng)即達(dá)到最高點(diǎn)，相比于其他條件，此條件下的反應(yīng)速率和GSH 濃度都最高，分別達(dá)到了(19.5 ± 0.3)mmol/(L·h)和(39 ± 0.5)mmol/L，得率達(dá)到了78%，因此45 ℃為GSH 催化的最適溫度。偶聯(lián)體系的最適反應(yīng)溫度偏高，與GshF 和PPK 的催化性質(zhì)一致，因?yàn)槎叩拇呋钚远茧S著溫度的升高而提高[12]。

2.3.4 酶比的優(yōu)化 在多酶催化體系中，不同的酶比可以影響反應(yīng)體系中的各個級聯(lián)反應(yīng)速率，從而影響總反應(yīng)速率和生產(chǎn)效率，因此，在GSH 生產(chǎn)系統(tǒng)中，通過酶比的優(yōu)化，可以平衡ATP 的生成和消耗，從而提高反應(yīng)效率。在體系中考察了PPK 與GshF 質(zhì)量濃度比分別為4∶1，3∶1 和2∶1 時(shí)酶比對反應(yīng)的影響，為了防止底物氨基酸對反應(yīng)的限制，在體系中將前體的濃度提高至120 mmol/L，如圖7 所示，當(dāng)PPK 質(zhì)量濃度從2 g/L 增加到4 g/L 時(shí)，GSH 的催化效率也在不斷增加，GSH 的濃度從 (45 ± 0.2)mmol/L 增加到(58 ± 3.3)mmol/L，反應(yīng)速率從(15 ± 0.03)mmol/(L·h)增加到(19.3 ± 1.1)mmol/(L·h)。因?yàn)樵陔p酶反應(yīng)中，PPK 為ATP 合成反應(yīng)，因此，增加PPK 的濃度，可以使得ATP 的再生速率增大，從而增加了總反應(yīng)速率，提高GSH 濃度。這也說明體系中ATP 的再生速率對總催化速率的限制作用。隨著反應(yīng)進(jìn)行，GSH 合成速率逐漸降低，導(dǎo)致半胱氨酸沒有被進(jìn)一步利用，可能是體系中polyP 降解和GSH 生成導(dǎo)致的pH 的下降，使得PPK 和GshF 酶活降低，無法高效生產(chǎn)GSH[12]。

圖 7 PPK/GshF 酶比對GSH 合成的影響Fig. 7 Effect of ratio of PPK to GshF on the synthesis of GSH

3 結(jié)束語

本文通過構(gòu)建雙酶級聯(lián)反應(yīng)，利用GshF 偶聯(lián)PPK 酶法合成GSH。對GshF 和PPK 誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，兩者均在18 ℃下可溶表達(dá)量最高。對GshF 和PPK 純化后，建立純酶反應(yīng)系統(tǒng)，優(yōu)化反應(yīng)條件，認(rèn)為polyP 與MgCl2濃度比在30∶45 下，ADP濃度為0.5 mmol/L，反應(yīng)溫度為45 ℃時(shí)，反應(yīng)速率最快。當(dāng)PPK 質(zhì)量濃度為4 g/L，GshF 質(zhì)量濃度為1 g/L 時(shí)，3 h 內(nèi)GSH 濃度達(dá)到了(58 ± 3.3)mmol/L。Yu 等報(bào)道了利用乙酸激酶再生ATP 的系統(tǒng)生產(chǎn)GSH，3 h 時(shí)濃度達(dá)到了59 mmol/L，是目前報(bào)道的GSH 的最高濃度[14]，但此系統(tǒng)所用的高能磷酸化合物為乙酰磷酸，價(jià)格昂貴，且不穩(wěn)定。本研究中的底物polyP 來源廣泛，價(jià)格低廉，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，因此，建立的低成本、高效的酶法合成體系為GSH 大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用提供了參考依據(jù)。