沈玉江 ，雷亞峰 ，劉健 ，鄭亮 ，張雅婷 ，王顯赫 ，武雪寧 ，徐嘉欣 ，郭德軒 ，李鈺昌 ，劉昕旸 ，徐淑艷 ，李鵬飛 ，曹宏偉 ，吳志軍 ，張華

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶163319；2.大慶華理生物技術(shù)有限公司；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)理學(xué)院；4.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院腎內(nèi)科）

脂肽表面活性劑主要包括表面活性素（Surfactin）、伊枯草菌素（Iturin）和芬薺素（Fengycin）三大類，其中，Surfactin具有優(yōu)良的乳化及發(fā)泡能力，其較強(qiáng)的表面活性可將水的表面張力由72 mN·m-1降至27 mN·m-1[5]；同時(shí)，還具有抗細(xì)菌、抗病毒、抗腫瘤和支原體等生物活性[6-7]，被廣泛應(yīng)用于石油開采、環(huán)境治理、生物醫(yī)藥、農(nóng)牧業(yè)等領(lǐng)域[1-4]。

目前脂肽類surfactin工業(yè)化發(fā)酵產(chǎn)率不高[8-9]，制約了脂肽類surfactin的多領(lǐng)域應(yīng)用，所以，在降低成本的同時(shí)提升脂肽類surfactin的發(fā)酵產(chǎn)率，對其多領(lǐng)域應(yīng)用也具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

surfactin的產(chǎn)量與菌株有關(guān)[10-11]，同時(shí)，與培養(yǎng)基的碳源、氮源、礦物質(zhì)等組成密切相關(guān)，此外，添加氨基酸對surfactin產(chǎn)量有重要影響[12-15]。近年開展了利用響應(yīng)面法等多種方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究[16-20]，以surfactin工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)原料為基礎(chǔ)，利用組合碳源、組合氨基酸模式，優(yōu)化規(guī)模化生產(chǎn)中培養(yǎng)基的種類及用量，利用單批培養(yǎng)單因素法優(yōu)化該菌產(chǎn)脂肽的最佳碳源、氮源，并在此基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面篩選培養(yǎng)基中影響surfactin產(chǎn)量的重要影響因素，大幅度提高了工業(yè)化surfactin產(chǎn)量，為surfactin工業(yè)化生產(chǎn)降低原料成本找到了新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

枯草芽孢桿菌YH1為實(shí)驗(yàn)室保存。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g·L-1，酵母膏 0.3 g·L-1，蛋白胨 5 g·L-1，NaCl 0.25 g·L-1，pH 7.0。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g·L-1、酵母粉0.3 g·L-1，KH2PO41 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.02 mg·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02 mg·L-1，氯化鈣 0.2 mg·L-1，硫酸鋅0.02 mg·L-1，L-谷氨酸鈉 1 mg·L-1，硫酸錳 0.01 mg·L-1，pH 7.0，35 ℃培養(yǎng) 48 h，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定 200 r·min-1。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：用接種環(huán)刮取一環(huán)斜面菌種，接種于裝有60 mL種子培養(yǎng)基的200 mL三角瓶中，封口膜封口，35 ℃，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定 200 r·min-1，振蕩培養(yǎng) 16 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：吸取5 mL種子液接種于裝有150 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，封口膜封口，35℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng) 48 h。

1.2.2 分析方法

surfactin干重測定：取100 mL發(fā)酵液，用6 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至11，離心機(jī)10 000 r·min-1離心10 min，收集上清。用6M HCl將上清液調(diào)至pH 2以下，低溫（0～4 ℃）下放置 12 h。10 000 r·min-1離心20 min，收集沉淀，甲醇抽提沉淀，0.22μm的濾膜過濾后粗提物，105℃烘干至恒重（2 h），冷卻后稱重，計(jì)算surfactin粗品干重[21-24]。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以surfactin的產(chǎn)量為指標(biāo)，每組檢測重復(fù)3次，取平均值，優(yōu)化YH1菌株對碳源、氮源的影響。

碳源優(yōu)化：參照初始發(fā)酵培養(yǎng)基，以氯化銨為氮源，碳源總濃度設(shè)定為1%，以單一碳源、混合碳源優(yōu)化，混合碳源均為1∶1配比，見表1。

表1 碳源對surfactin產(chǎn)量影響Table 1 Effects of carbon sources on surfactin yield

氮源優(yōu)化：以優(yōu)選的最適碳源及濃度，在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入0.25%的不同氮源，培養(yǎng)48 h，設(shè)計(jì)見表2。

表2 氮源種類對surfactin產(chǎn)量影響Table 2 Effects of nitrogen sources on surfactin yield

氨基酸種類優(yōu)化：在確定了碳源、氮源的基礎(chǔ)上，選擇了四組氨基酸組分對surfactin的產(chǎn)量的改變情況進(jìn)行研究，每種氨基酸各加入0.02 mg·L-1，設(shè)計(jì)見表3。

表3 不同氨基酸對surfactin產(chǎn)量的影響Table 3 Effects of different amino acids on surfactin yield

1.2.4 Plackett-Burnan設(shè)計(jì)

在已篩選出的最適碳源、氮源及氨基酸的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Placket-Burman（PB）兩水平法考察培養(yǎng)基中影響surfactin產(chǎn)量的主要因素，試驗(yàn)各因素的編碼和取值范圍見表4，其中X1～X11不同培養(yǎng)基成分，分別為X1淀粉+米糠油（1∶1）、X2豆粕水解液、X3酵母粉、X4磷酸二氫鈉 、X5七水硫酸鎂、X6 L-谷氨酸鈉、X7氯化鈣、X8硫酸鋅、X9硫酸錳、X10七水硫酸亞鐵、X11 氨基酸（Thr，Met），每組試驗(yàn)重復(fù)3次；每個(gè)因素取高低兩個(gè)水平，以surfactin的產(chǎn)量作為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表4、表5。

1.2.4.1 最陡爬坡試驗(yàn)

對Placket-Burman試驗(yàn)篩選出的關(guān)鍵影響因素，以試驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较颍鶕?jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長，最快地逼近最佳值區(qū)域；對surfactin產(chǎn)量影響不顯著的其他因素，表現(xiàn)為正效應(yīng)的取高水平，負(fù)效應(yīng)的取低水平，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，具體試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)見表6。

1.2.4.2 中心復(fù)合試驗(yàn)及響應(yīng)面分析

為了描繪響應(yīng)曲面的結(jié)果的特征、分析最大產(chǎn)值結(jié)果的條件，在使用最陡爬坡法逼近產(chǎn)量最佳值區(qū)域后，根據(jù)得到的數(shù)據(jù)來確定響應(yīng)的中心點(diǎn)，采用Design Experts軟件進(jìn)行中心復(fù)合試驗(yàn)，試驗(yàn)每個(gè)因素分別取3個(gè)水平，各因素編碼及試驗(yàn)水平見表7，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表8，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，并以中心復(fù)合試驗(yàn)結(jié)果來進(jìn)一步利用進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，以響應(yīng)曲面和相應(yīng)的等值線圖分析各因素間相互作用對surfactin產(chǎn)量的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 最適碳源確定

從表1、圖1中可以看出，無碳源供應(yīng)時(shí)，菌體幾乎不能產(chǎn)脂肽，單一碳源組；應(yīng)用蔗糖、麥芽糖、米糠油和淀粉 surfactin產(chǎn)量分別在 0.411、0.397、0.323、0.317 g·L-1，相對高于單糖組的葡萄糖 0.271 g·L-1、大豆油 0.242 g·L-1、甘油 0.204 g·L-1、乳糖 0.042 g·L-1；組合碳源中以淀粉和米糠油（1∶1）surfactin產(chǎn)量0.554 g·L-1，高于葡萄糖+淀粉（1∶1）surfactin 產(chǎn)量0.474 g·L-1、蔗糖+大豆油（1∶1）surfactin 產(chǎn)量 0.445 g·L-1、甘油+麥芽糖（1∶1）surfactin 產(chǎn)量 0.342 g·L-1，淀粉+米糠油（1∶1）為碳源時(shí)surfactin的產(chǎn)量高出單一碳源蔗糖34.8%、麥芽糖39.54%、淀粉74.76%，米糠油71.5%，葡萄糖104.4%；高出其他混合碳元組16.9%～62%，差異顯著性分析表明淀粉+米糠油（1∶1）與其他碳源相比極顯著性（P＜0.01），因此，選擇淀粉+米糠油（1∶1）作為碳源進(jìn)行下一步的研究。

圖1 碳源對surfactin產(chǎn)量影響Fig.1 Effects of carbon sources on surfactin yield

2.2 最適氮源確定

表2及圖2可見，各氮源中，氯化銨、尿素、牛肉膏、豆粕水解液Surfactin產(chǎn)量分別為0.443、0.446、0.396及0.687 g·L-1；差異顯著性分析表明，豆粕水解液作為氮源時(shí)surfactin產(chǎn)量相對其他氮源，差異極顯著（P＜0.01），因此，選用豆粕水解液為氮源。

圖2 氮源種類對surfactin產(chǎn)量影響Fig.2 Effects of nitrogen sources on surfactin yield

2.3 最適氨基酸種類的確定

表3及圖3可見，與無氨基酸組比較，培養(yǎng)基中添加Thr和Met與不添加氨基酸及其他組合氨基酸相比其surfactin產(chǎn)量具有差異顯著性（P＜0.05）因此，選擇Thr，Met組作為優(yōu)化培養(yǎng)基組分。

圖3 不同氨基酸對surfactin產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of different amino acids on surfactin yield

2.4 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選影響surfactin產(chǎn)量的顯著因素

PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)是Plackett-Burman提出的，一種應(yīng)用最少的試驗(yàn)次數(shù)和盡可能高的精確度，就可以從大量的影響因素中篩選出對目標(biāo)值最大的影響因素，是一種基于不完全平衡塊原理的兩水平部分因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法[25]。設(shè)計(jì)是在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用N=12的PB試驗(yàn)，對初始發(fā)酵培養(yǎng)基中X1淀粉+米糠油（1∶1）、X2豆粕水解液、X3酵母粉、X4 磷酸二氫鈉、X5七水硫酸鎂、X6 L-谷氨酸鈉、X7氯化鈣、X8硫酸鋅、X9硫酸錳、X10七水硫酸亞鐵、X11氨基酸（Thr，Met）等11個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)因素兩個(gè)水平，即高水平（+）和低水平（-），其中高水平是低水平的 2倍，響應(yīng)值（Y）為 surfactin產(chǎn)量（g·L-1），結(jié)果見表4，然后利用Mintab15軟件對結(jié)果進(jìn)行分析，各因素的編碼水平、主效應(yīng)分析見表5。由表5可見，淀粉+米糠油（1∶1）、豆粕水解液、氯化鈣及 L-谷氨酸鈉是對surfactin產(chǎn)量影響極其顯著的因素。

表5 各因子試驗(yàn)水平及主效應(yīng)分析Table 5 Experimental factor levels and principal effects of each factor

表4 N=12的PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值Table 4 Plackett-Burman design and response values of N=12

2.5 最陡爬坡試驗(yàn)篩選顯著影響因素的最佳濃度的條件

根據(jù)表 5 的結(jié)果，X1 淀粉+米糠油（1∶1）、X2豆粕水解液、X7氯化鈣、X6 L-谷氨酸鈉對surfactin產(chǎn)量均具有顯著影響，考慮到在實(shí)際大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)中前三者用量較大，因此，確定淀粉+米糠油（1∶1）、豆粕水解液、氯化鈣作為主要影響因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，根據(jù)影響因素氯化鈣具有的負(fù)效應(yīng)，減少設(shè)計(jì)用量，淀粉+米糠油（1∶1）、豆粕水解液均具有正效應(yīng)，增加設(shè)計(jì)用量。通過三者效應(yīng)值的大小確定了最陡爬坡試驗(yàn)的步長及變化方向，剩余因素均取初始水平，最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6，由表可知，各因素最佳濃度的條件位于第六組附近，所以取第六組試驗(yàn)設(shè)計(jì)值為中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面分析。

表6 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Experimental design and results of steepest ascent

2.6 中心復(fù)合試驗(yàn)建立顯著影響因素的二次線性回歸模型

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)所確定的中心點(diǎn)，采用三因素五水平的中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)。以發(fā)酵48 h后的surfactin產(chǎn)量Y（g·L-1）為響應(yīng)值，以表6中第六組試驗(yàn)條件為中心點(diǎn)，各因素的編碼水平見表7，中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表8。

表7 中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素及水平Table 7 Factors and levels of central composite experimental design

表8 中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 8 Design and results of central composite experiment

應(yīng)用Design Experts軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，并擬合出響應(yīng)值 Y 與淀粉+米糠油（1∶1）（A），豆粕水解液（B），氯化鈣（C）三個(gè)因素之間的二次線性回歸模型為：

Y=-2.153 22+0.174 79A+0.368 3B+0.455 84C+0.003 691 41AB+0.000 647 321AC+0.006 339 29BC-0.002 919 15A2-0.027 924B2-0.069 898C2

該二次回歸模型的方差分析及可信度分析見表9與表10，由表9中模型的F值為34.8，大于F值的概率P＜0.000 1，說明模型是顯著的。該模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.969 1，說明該模型可以解釋96.91%的試驗(yàn)所得出的surfactin的產(chǎn)率變化，模型擬合度較好，變異系數(shù)CV值較低為12.57%，說明試驗(yàn)操作具有可信性。設(shè)計(jì)試驗(yàn)的Adeq Precision值＞4為15.769，進(jìn)一步說明該模型在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，可以很好的反映響應(yīng)值與響應(yīng)因素變量的變化趨勢，模型具有可用性。

表9 回歸方程的方差分析Table 9 ANOVA of regression equation

表10 模型可信度的分析Table 10 Credibility analysis of the model

圖4 A-豆粕水解液（B）與淀粉+米糠油（A）對surfactin產(chǎn)量的曲面圖和等高線圖Fig.4 A-response surface plot and contour plot of（B）soybean meal hydrolysate and（A）starch+rice bran oil on surfactin yield

圖4 B-淀粉+米糠油（A）與氯化鈣（C）對surfactin產(chǎn)量的曲面圖和等高線圖Fig.4 B-response surface plot and contour plot of（A）starch+rice bran oil and（C）calcium chloride on surfactin yield

圖4 C-豆粕水解液（B）與氯化鈣（C）對surfactin產(chǎn)量的曲面圖和等高線圖Fig.4 C-response surface plot and contour plot of（B）soybean meal and（C）calcium chloride on surfactin yield

通過圖4，A、B、C的3D曲面圖及相應(yīng)的等高線圖可反映出來以上模型中的三個(gè)因素與響應(yīng)值surfactin的相互作用，從圖中可以看出，響應(yīng)值Y存在最大值。經(jīng)過軟件進(jìn)一步分析得出，surfactin的最大值Y為3.76 g·L-1，此時(shí)的三個(gè)影響因素的值A(chǔ)（淀粉+米糠油）（1∶1） 為 32 g·L-1，B 豆粕水解液 8 g·L-1，C 氯化鈣 4.5 mg·L-1。

2.7 模型驗(yàn)證試驗(yàn)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證該模型的準(zhǔn)確性及重復(fù)性，進(jìn)行以初始發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照，應(yīng)用上述得出的各因素值配制發(fā)酵培養(yǎng)基濃度，每組設(shè)置3個(gè)平行，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)。優(yōu)化前surfactin試驗(yàn)結(jié)果分別為1.48，1.53，1.59 g·L-1，平均值 1.53 g·L-1；優(yōu)化后 surfactin 產(chǎn)量 3.59，3.32，3.55 g·L-1，平均值 3.48 g·L-1，比優(yōu)化前的產(chǎn)量提高了127.45%，同時(shí)，驗(yàn)證值是預(yù)測最大值的92.55%，接近度高，說明該模型可以較好地反映出脂肽surfactin與因素變化關(guān)系及趨勢。

3 結(jié)論

研究首先用單因素試驗(yàn)優(yōu)化YH1菌產(chǎn)surfactin發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源、氮源，并優(yōu)選出最適添加的氨基酸種類；然后利用PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出對surfactin產(chǎn)量影響顯著的淀粉+米糠油（1∶1），豆粕水解液，氯化鈣三個(gè)因素；通過最陡爬坡試驗(yàn)確定了實(shí)施響應(yīng)面分析的中心點(diǎn)處3個(gè)因素的濃度；最后利用中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面擬合分析，得到了能夠很好反映surfactin產(chǎn)量變化的二次線性回歸模型。通過求解回歸方程，得出了surfactin產(chǎn)量取最大值3.76 g·L-1時(shí)各因素的濃度，分別為淀粉+米糠油（1∶1）32 g·L-1、豆粕水解液 8 g·L-1、氯化鈣 4.5 mg·L-1、酵母粉 0.3 g·L-1，KH2PO41 g·L-1，Mg－SO4·7H2O 0.02 mg·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02 mg·L-1，硫酸鋅0.02 mg·L-1，L-谷氨酸鈉 1 mg·L-1，硫酸錳 0.01 mg·L-1，氨基酸：Thr和 Met各 0.02 mg·L-1，pH 7.0，35 ℃條件下200 r·min-1震蕩培養(yǎng)48 h。通過模型的進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)，驗(yàn)證值surfactin產(chǎn)量比優(yōu)化前的產(chǎn)量提高了127.45%，同時(shí)，驗(yàn)證值是模型預(yù)測最大值的92.55%，具有較高的可靠性，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌YH1菌產(chǎn)脂肽表面活性素發(fā)酵培養(yǎng)基的模型具有可靠性。