馮琳，王媛，范春桃，王寶奇，賀鑫梅，于楠楠，毛瑩瑩，練旭冬，韓英浩

（黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術學院，大慶 163319）

隨著年齡的增長，人體皮膚的修復能力會逐漸減弱，這一現(xiàn)象在老年人上尤為明顯。老年人皮膚傷口常常出現(xiàn)愈合速度慢，愈后結(jié)疤瘢等現(xiàn)象，嚴重減低著老年人的生活質(zhì)量[1-3]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞分泌的 EGF、FGF2、IGF、PDGF、VEGF、IL-1、IL-10等多種細胞因子能夠明顯促進傷口愈合，這些細胞因子通過促進細胞增殖、分化、血管生成、抑制炎癥反應等幾個方面參與皮膚組織生成[4-5]。間充質(zhì)干細胞分泌因子不僅可繞過與細胞治療有關的免疫相容性、疾病傳染性等問題，還可以批量生產(chǎn)，長期保存，降低細胞培養(yǎng)所需的時間和成本，因此間充質(zhì)干細胞分泌因子對于創(chuàng)傷、腦缺血、心肌梗塞等疾病的治療更具優(yōu)勢。但間充質(zhì)干細胞分泌因子成分復雜，各細胞因子通過何種方式發(fā)揮促進老化皮膚創(chuàng)傷愈合的詳細調(diào)控機制目前尚不可知，這在一定程度上抑制間充質(zhì)干細胞分泌因子的臨床應用。因此，探究真皮間充質(zhì)干細胞分泌因子治療老化皮膚創(chuàng)傷的相關分子機制具有十分重要的意義。

成纖維細胞是皮膚創(chuàng)傷中主要的修復細胞，當皮膚發(fā)生創(chuàng)傷時，成纖維細胞在多種細胞因子的刺激下，會大量增殖，遷移并分泌膠原蛋白及細胞外基質(zhì)填補創(chuàng)傷部位，從而達到促進傷口愈合的目的。實驗采用卡波姆為凝膠基質(zhì)，添加富含真皮間充質(zhì)干細胞分泌因子的條件培養(yǎng)液，制成分泌因子凝膠劑，治療老化小鼠皮膚創(chuàng)傷，闡明真皮間充質(zhì)干細胞分泌因子通過激活細胞內(nèi)ErK1/2信號通路，加快真皮成纖維細胞增殖，促進老化皮膚創(chuàng)傷愈合，不僅為干細胞相關制劑的研發(fā)提供技術手段，也為干細胞相關制劑的臨床應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物為SPF級野生型129/SvJ小鼠，購自韓國生命工學院。8月齡野生型小鼠12只，雌雄各半，自由飲食，室溫控制在25℃左右，12 h暗/光周期飼養(yǎng)。所有的動物程序都是按照KRIBB機構(gòu)動物護理和使用委員會的規(guī)定進行的。

1.2 主要試劑

蘇木精試劑，購買自上海蘭秀公司；伊紅試劑，購買自天津大茂化學公司；硫酸鐵銨、酸性品紅、磷鉬酸、苯胺藍試劑，購買自阿拉丁化學公司；高熔點石蠟，購買自德國Leica公司；卡波姆940，購買自麥克林公司；蛋白免疫印跡相關試劑，購買自Amresco公司；PCNA、Cyclin-D1、ErK、p-Erk 抗體，購買自美國Santa Cruz公司；DMEM，購買自索萊寶公司；胎牛血清，購買自索萊寶公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠真皮間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基的制備

將真皮間充質(zhì)干細胞從液氮罐中取出，復蘇至10 cm細胞培養(yǎng)皿，使用含有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素和鏈霉素（P/S）的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，放入37℃、含5%二氧化碳（CO2）的恒溫培養(yǎng)箱中。6 h后觀察細胞貼壁情況。當細胞生長至細胞融合率達70%～80%時，棄去原來培養(yǎng)液，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)并加入100μL NEAA以及10μL B27，培養(yǎng)12 h后收集真皮間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)上清液，將回收的真皮間充質(zhì)干細胞上清液以2 000 rpm，離心10 min，0.22μm濾膜過濾去除細胞碎片。即獲得真皮間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基，以每管1 mL進行分裝，儲存在-80℃冰箱用于后續(xù)實驗。

1.3.2 卡波姆凝膠劑的制備

首先用電子天平稱取0.04 g卡波姆加入4 mL濃度為0.1 mol·L-1的NaOH溶液，再加入11 mL蒸餾水，溶脹過夜。第二天呈膠凍狀，加入真皮間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基5 mL攪拌均勻，進行分裝，分裝后置于冰箱4℃保存，用于后續(xù)實驗。

1.3.3 老化小鼠皮膚創(chuàng)傷實驗

采用8月齡老齡鼠12只，采用0.25%Avertin進行腹腔注射，用于麻醉小鼠，對小鼠背部皮膚5 cm×5 cm區(qū)域進行脫毛處理，先用推子剃去長毛發(fā)，再涂抹脫毛膏去除短的毛發(fā)，擦去多余脫毛膏，采用酒精、碘伏對脫毛區(qū)進行消毒，選取距脊柱1 cm的腰后部位置，制作直徑為5 mm的圓形傷口。分泌因子組小鼠每天定時定量涂抹制作的真皮間充質(zhì)干細胞分泌因子凝膠，空白對照組小鼠不進行處理，將每只小鼠單籠喂養(yǎng)，自由進食，連續(xù)9 d拍照觀察，對創(chuàng)面面積進行統(tǒng)計學分析。

1.3.4 組織切片及H&E染色

組織切片：脫頸處死小鼠，取背部傷口處皮膚1 cm×1 cm固定于硝酸纖維膜上，按如下流程進行處理，10%福爾馬林液固定24 h，流水沖洗1.5 h，進行脫水處理，70%酒精浸泡40 min，80%酒精浸泡50 min，90%酒精浸泡1 h，95%酒精浸泡1 h，100%酒精浸泡1 h，100%酒精浸泡 1 h，100%二甲苯浸泡 30 min，100%二甲苯浸泡30 min，100%二甲苯浸泡1 h，高熔點石蠟浸泡30 min，高熔點石蠟浸泡30 min，高熔點石蠟浸泡1 h 30 min。共計9.5 h后對樣品進行石蠟包埋，放在冷凍機上將石蠟進行冷凍，去除周圍多余的蠟片，將蠟塊從包埋盒中起下來，將蠟塊修成平整梯形，用切片機先以厚度為10μm進行修片，再以厚度為0.5μm進行切片，于42℃攤片機上攤片，用載玻片將其挑起，室溫晾片12 h后進行染色。

H&E染色：切片后按照如下流程進行染色處理，100%二甲苯（10 min）-100%二甲苯（10 min）-100%酒精（1 min 30 s）-100%酒精（1 min）-90%酒精（1 min）-80%酒精（1 min）-50%酒精（1 min）-水洗（3 min）-蘇木精（5 min）-水洗（3 min）-1%酸酒精（0.2 s）-水洗（3 min）-0.8%氨水（0.2 s）-水洗（5 min）-伊紅（1 min）-95%酒精（1 min）-95%酒精（1 min）-100% 酒精（1 min）-100%酒精（30 s）-100% 二甲苯（30 s）-100%二甲苯（30 s）-100%二甲苯（1 min）。用中性樹膠進行封片處理，室溫風干12 h。用熒光顯微鏡觀察傷口部位皮膚厚度，肉芽組織填充情況，以及上皮組織完整程度，統(tǒng)計學分析皮膚厚度和傷口大小。

1.3.5 MTT assay分析

將離心后的真皮成纖維細胞加入培養(yǎng)液，吹打混勻，以1×104個/mL的濃度種于96孔板中，每孔加入100μL細胞懸液，置于5%CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，將空白對照組與真皮間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基組分別更換含2%FBS的DMEM以及之前制備好的真皮間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基，每孔加入100μL。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入10μL MTT，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄掉培養(yǎng)液后每孔加入100μL DMSO混勻，避光孵育10 min，酶標儀檢測570 nm處的吸光度值，并對所得實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

1.3.6 蛋白質(zhì)免疫印跡分析

收集細胞置于1.5 mL離心管內(nèi)。每組加入0.05 mL細胞裂解液，于冰上裂解，每 5 min敲打一次，共5次，然后在4℃下8 000 rpm離心30 min，離心結(jié)束，將1.5 mL的Tube放在裝有冰的盒子里，小心吸取管中液體，移至1.5 mL的Tube中，回收上清。根據(jù)800μL DDW，200μL考馬斯亮藍，1μL蛋白樣品的比例配制定量體系，檢測溶液中蛋白質(zhì)濃度，并在495 nm處用分光光度計進行檢測，統(tǒng)計數(shù)值。據(jù)標準蛋白質(zhì)曲線計算蛋白質(zhì)濃度，將蛋白質(zhì)樣品定量為30μg，沸水浴5 min，使上清液中的蛋白質(zhì)變性，放入-20℃冰箱備用。將膠板與模具進行清洗后，放到架子上晾干。將膠板安裝在模具上，加入DDW進行檢驗是否漏水。未發(fā)現(xiàn)漏水現(xiàn)象后，配制下層膠。用旋渦振蕩器混勻后，加入到膠板內(nèi)，再加入DDW進行壓平。下層膠（分離膠）成形后，開始配制上層膠（濃縮膠），根據(jù)樣本的數(shù)量，選擇合適的梳子，在上層膠未成形以前插入。拔去梳子后，將膠板取下，清洗膠板表面的膠，安裝到電泳槽中，并加入電泳液（Electron Buffer）留以備用。蛋白質(zhì)經(jīng)12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，將膠從電泳槽中取出，按照陰極—海綿墊—濾紙—分離膠—NC膜（美國Millipore公司）—濾紙—海綿墊—陽極的順序安裝轉(zhuǎn)膜夾，將轉(zhuǎn)膜夾放入轉(zhuǎn)膜桶，倒入轉(zhuǎn)膜液。在4℃條件下通電，130 mA過夜轉(zhuǎn)膜。用0.1%麗春紅染色并進行剪膜，用1×TBST含有15 mmol·L-1的NaCl（Tris-HCL，TBS）、0.2%Tween-20、10 mmol·L-1的Tris-HCl洗滌直到麗春紅洗凈為止，脫脂乳封閉1 h，用 1×TBST 洗 5 次，每次 5 min，加入 α-tubulin、ErK、p-ErK、cyclinD1、PCNA 單克隆抗體于 4℃冰箱中孵育過夜，回收一抗，用1×TBST洗滌5次，每次5 min，脫脂乳封閉10 min，使用1×TBST將一抗洗凈，在搖床上快搖，每5 min更換一次，共洗滌30 min。按照一抗對應加入1μL二抗（山羊抗小鼠、山羊抗兔）室溫孵育1 h，用TBST洗滌5次，每次5 min。配制ECL超敏發(fā)光液，避光保存。利用增強化學發(fā)光（ECL）技術，用辣根過氧化酶偶聯(lián)的二抗檢測結(jié)合抗體，并對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

1.3.7 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示，組間差異采用t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異，P＜0.01為有顯著統(tǒng)計學差異，P＜0.001為有極其顯著的統(tǒng)計學差異，所有數(shù)據(jù)Image J軟件進行統(tǒng)計學分析。每組實驗均重復3次。

2 結(jié)果

2.1 真皮間充質(zhì)干細胞分泌因子凝膠劑能促進老化皮膚創(chuàng)傷愈合

為研究真皮間充質(zhì)干細胞（DMSCs）分泌因子對衰老小鼠創(chuàng)傷愈合的影響，采用DMSCs分泌因子凝膠劑處理衰老小鼠皮膚全層切除模型，觀察衰老小鼠創(chuàng)傷愈合的情況。結(jié)果表明，分泌因子凝膠組在愈合過程中傷口面積明顯小于空白對照組（圖1A），經(jīng)統(tǒng)計學分析，分泌因子組的傷口面積顯著低于空白對照組（圖1B），H&E染色結(jié)果表明，第9 d時，各組均有肉芽組織填埋傷口，分泌因子凝膠組創(chuàng)面已被填埋，上皮完整，愈合基本完成；空白對照組上皮較薄，再生不完全（圖1C）。表明真皮間充質(zhì)干細胞分泌因子凝膠劑能夠促進老化皮膚創(chuàng)傷愈合。

2.2 真皮間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基能促進真皮成纖維細胞增殖

為了探究DMSCs分泌因子促進老化皮膚創(chuàng)傷愈合的機制，采用含有DMSCs分泌因子的條件培養(yǎng)基處理真皮成纖維細胞，利用MTT法檢測真皮成纖維細胞的細胞活力；利用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測增殖相關蛋白PCNA、CyclinD1表達水平。結(jié)果表明，與空白對照組相比，DMSCs條件培養(yǎng)基組處理后的真皮成纖維細胞的細胞活力顯著增加（圖2A），增殖相關蛋白PCNA、Cyclin D1表達水平顯著上升（圖2B）。表明DMSCs條件培養(yǎng)基能促進真皮成纖維細胞增殖。

圖1 DMSCs分泌因子凝膠劑對老化小鼠皮膚傷口愈合的影響Fig.1 Effect of DMSCs secretory factor gel on wound healing of skin in aging mouse

圖2 DMSCs-CM能促進真皮成纖維細胞的增殖Fig.2 DMSCs-CM promoting the dermal fibroblasts proliferation

2.3 真皮間充質(zhì)干細胞分泌因子通過Er K1/2信號通路促進真皮成纖維細胞增殖

ErK1/2是MAPK信號通路的重要成員，通過磷酸化其底物，參與細胞增殖、應激、分化、凋亡和炎癥的調(diào)控[6]。為了探究DMSCs分泌因子促進真皮成纖維細胞增殖的分子機制，在分子水平上檢測真皮成纖維細胞內(nèi)ErK1/2，p-ErK1/2蛋白表達水平。結(jié)果表明，與空白對照組相比DMSCs條件培養(yǎng)基組p-ErK1/2表達水平顯著上升，ErK1/2表達水平基本不變（圖3）。這說明，真皮間充質(zhì)干細胞分泌因子可以通過調(diào)節(jié)真皮成纖維細胞內(nèi)的ErK1/2信號通路促進真皮成纖維細胞增殖。

圖3 DMSCs分泌因子通過Er K1/2信號通路促進真皮成纖維細胞增殖Fig.3 DMSCs secretion factor promoting dermal fibroblasts proliferation by ErK1/2

3 討論

隨著全世界老齡化人口數(shù)量的不斷增加，老年群體創(chuàng)傷發(fā)生率越來越高，值得關注的是常規(guī)治療創(chuàng)傷的方法對于老年創(chuàng)傷患者治療效果并不明顯。因此，探究有效治療老化皮膚創(chuàng)傷的方法具有重要意義。研究表明，間充質(zhì)干細胞對皮膚創(chuàng)傷具有良好的治療效果，無論是內(nèi)源性干細胞還是移植的外源性干細胞均能起到促進傷口愈合的作用。起初人們認為，間充質(zhì)干細胞治療傷口愈合主要是通過自身的增殖、分化來替代和補充受損傷的細胞，但最新的研究表明，移植的外源性間充質(zhì)干細胞在傷口部位存活率較低，也極少會分化成其他的細胞，同時發(fā)現(xiàn)即使植入的間充質(zhì)干細胞遠離實際損傷部位，但仍可以促進傷口愈合[7-8]，因此研究人員認為間充質(zhì)干細胞是可能通過旁分泌的方式發(fā)揮治療效果。

在皮膚創(chuàng)傷愈合過程中，真皮成纖維細胞被認為是參與皮膚組織再生的主要細胞，它參與了皮膚創(chuàng)傷愈合一些關鍵的過程[9-11]。在炎癥階段結(jié)束增殖階段開始時，真皮成纖維細胞會快速增殖，然后分泌多種基質(zhì)金屬蛋白酶來膨脹和降解纖維蛋白凝塊，并將其替換為細胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白IIV、XVIII、糖蛋白、蛋白聚糖、層粘連蛋白、血小板反應蛋白、糖胺聚糖（GAGs）、透明質(zhì)酸（HA）和硫酸肝素[12]。這種復雜的基質(zhì)支持并調(diào)控成纖維細胞的遷移和活性，同時也為血管生成、肉芽組織生成和上皮化提供支持和信號[13-14]，進而促進皮膚創(chuàng)傷愈合。研究表明脂肪間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基（ASCs-CM）中bFGF、EGF均可顯著促進真皮成纖維細胞的增殖[15]。骨髓間充質(zhì)干細胞能分泌特殊的細胞因子如VEGF，igf-1，EGF等對傷口愈合很重要的細胞因子促進真皮成纖維細胞的增殖和遷移[16]。臍帶間充質(zhì)干細胞（MSCs）條件培養(yǎng)液能夠促進皮膚組織損傷修復，且經(jīng)ELISA測定，條件培養(yǎng)液中含有高濃度VEGF、IL-8、MCP-1生物活性因子[17]。這與實驗的結(jié)果相一致，研究采用真皮間充質(zhì)干細胞分泌因子凝膠劑治療老化皮膚創(chuàng)傷，結(jié)果顯示分泌因子凝膠組傷口愈合率顯著高于空白對照組；采用MTT法檢測真皮間充質(zhì)干細胞分泌因?qū)φ嫫こ衫w維細胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示分泌因子組真皮成纖維細胞的增殖速度明顯高于空白對照組。這表明，真皮間充質(zhì)干細胞分泌因子凝膠劑通過干細胞分泌的多種分泌因子促進成纖維細胞增殖加快老化皮膚創(chuàng)傷愈合。研究顯示FGF和TGFβ-1誘導的成纖維細胞增殖，并均能夠被ErK1/2特異性抑制劑所消除[18]，同時，實驗的研究結(jié)果也表明干細胞條件培養(yǎng)基處理真皮成纖維細胞，細胞內(nèi)的P-ErK1/2表達水平明顯升高。綜合以上的結(jié)果表明，真皮間充質(zhì)干細胞分泌因子可能是通過激活成纖維細胞內(nèi)ERK1/2信號通路，加快細胞增殖，促進老化皮膚傷口愈合。同時實驗推測ErK1/2信號通路可能是多種細胞因子調(diào)控成纖維細胞增殖的共同下游信號通路，這將是下一步研究的重點。

由于含有間充質(zhì)干細胞分泌因子的條件培養(yǎng)基為液體，不能長時間停留在傷口表面，嚴重抑制干細胞相關產(chǎn)品的治療效果。因此，需要選用一種能夠承載干細胞條件培養(yǎng)基的藥物，使得培養(yǎng)基內(nèi)的細胞因子更好的進入皮膚傷口部位，發(fā)揮治療效果。實驗采用卡波姆為凝膠基質(zhì)，卡波姆是主要用于皮膚治療劑的藥物輔料，是國家藥典中規(guī)定的藥物輔料，是多種凝膠基質(zhì)生物黏附材料、控緩釋制劑的骨架材料等。以卡波姆為基質(zhì)制作的凝膠劑易涂展、無油膩性，附著性和均勻性良好，對皮膚和黏膜無刺激性且使藥物呈零級或近似零級釋放[19-21]，能最大限度維持藥物療效。因此，研究通過制備真皮間充質(zhì)干細胞分泌因子凝膠劑，探究干細胞分泌因子對老化皮膚創(chuàng)傷愈合的影響，闡明真皮間充質(zhì)干細胞分泌因子通過ErK1/2信號通路促進真皮成纖維細胞增殖加速老化皮膚創(chuàng)傷愈合的作用，為治療老化皮膚創(chuàng)傷提供新思路。