何勇鵬，孫 迪，劉恩寵，何 杰，李 忌，王振華

(煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/線粒體與健康衰老研究中心，山東 煙臺(tái) 264005)

糖尿病心肌病是獨(dú)立于高血壓和冠心病等其他心血管病變之外的心臟病變[1],糖毒性、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體功能失常、脂毒性等都是其潛在發(fā)病機(jī)制，但其確切分子機(jī)制仍不清楚，現(xiàn)有研究表明氧化應(yīng)激是導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的重要原因.

活性氧(ROS)來(lái)源于細(xì)胞呼吸代謝過(guò)程中的副產(chǎn)物, 參與多種生理生化和病理過(guò)程中的信號(hào)傳導(dǎo)[2-5].線粒體是病理性ROS合成的關(guān)鍵位點(diǎn)，NADPH氧化酶(NOXs)則是細(xì)胞內(nèi)源性ROS產(chǎn)生的主要來(lái)源之一，與其他酶類生成ROS方式不同，而是通過(guò)將NADPH上的電子轉(zhuǎn)移到O2上產(chǎn)生ROS[6-9].NADPH氧化酶可作為細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵信使分子，其激活可通過(guò)多種信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10-12].

油酸(cleic acid,OA.結(jié)構(gòu)式如圖1)是構(gòu)成食用油脂中含量最高的單不飽和脂肪酸，亦是人體血漿中含量最高的游離脂肪酸之一[13].血漿油酸水平與胰島素抵抗相關(guān)，也是糖尿病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[14].心血管事件是糖尿病患者致死的首要危險(xiǎn)因素，2型糖尿病患者在未有明確血管受損時(shí)，亦有心臟功能受損表現(xiàn)，稱為糖尿病心肌病[15-16]. 本研究以油酸復(fù)制H9c2心肌細(xì)胞體外損傷模型，探究NADPH氧化酶在油酸誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的關(guān)鍵作用，為糖尿病心肌病的防治提供新的研究思路.

圖1 油酸結(jié)構(gòu)式

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系

H9c2(2-1)大鼠心肌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù).

1.2 儀器與設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司); 生物超凈臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司); 倒置相差顯微鏡(香港Motic公司); 多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices Corporation); ACEA NovoCyte TM系列流式細(xì)胞儀(艾森生物科學(xué)公司); Micro 21R高速冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific Inc); 數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市科興儀器廠); 電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司); MH-2 微孔板孵育振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司); 蛋白電泳儀器(美國(guó)BIO-RAD公司); Tanon5500凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司).

1.3 材料與試劑

油酸(美國(guó) Sigma公司); MTT粉末(北京 Biodee公司); 蛋白酶抑制劑(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA); BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA); NAC、 mito-TEMPO、 DCFH-DA探針美國(guó)(美國(guó)Sigma公司); DPI(美國(guó) Selleck 公司);β-actin一抗、Caspase 3(美國(guó) CST 公司)、一抗、Bax一抗、Bcl-2一抗(上海 Abcam 公司); HRP 耦聯(lián)山羊抗兔 IgG(美國(guó) Santa Cruz Biotechnology 公司).

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)基(含10% Gibco血清和雙抗)中，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至70%～80%融合時(shí)，用含0.25% EDTA胰酶消化細(xì)胞，傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

2.2 油酸的配制

精密量取1 mL 0.1 μmol/L的NaOH并將其加熱至75 ℃，將31.4 μL 油酸加入至NaOH中，超聲震蕩至完全溶解后，制備油酸母液濃度為100 mmol/L.以10% BSA為溶劑將油酸稀釋至濃度分別為2、4、8 mmol/L，使用0.22 μm濾膜過(guò)濾后，于-20 ℃分裝保存.使用前，將不同濃度油酸于37 ℃溫水浴溶解，使用時(shí)，將油酸按不同濃度與DMEM完全培養(yǎng)基1∶9進(jìn)行混合加入至BSA終濃度為1%.

2.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組

2.3.1 油酸干預(yù)實(shí)驗(yàn) 將H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組(不同濃度、不同時(shí)間油酸處理).

2.3.2 抑制劑干預(yù)實(shí)驗(yàn) 將H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、油酸組、抑制劑處理組、抑制劑與油酸聯(lián)用組(抑制劑提前30 min預(yù)處理).

2.4 細(xì)胞活力檢測(cè)

在96孔板中接種H9c2心肌細(xì)胞懸液(細(xì)胞2×104個(gè)·L-1，每孔100 μL)，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔.在37 ℃、 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，加入不同濃度含油酸的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)不同時(shí)間.處理終點(diǎn)后，吸棄原培養(yǎng)液，加入100 μL含10% MTT(5 mg/mL)的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱中孵育3 h.吸棄MTT培養(yǎng)液，每孔加入200 μL DMSO溶液，平板振蕩15 min，酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm吸光度，計(jì)算公式如下：細(xì)胞增殖活力=實(shí)驗(yàn)組A(校正后) /對(duì)照組A(校正后)× 100 %

2.5 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)

在6孔板中接種H9c2心肌細(xì)胞懸液(細(xì)胞5×104個(gè)·L-1，每孔100 μL)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔.在37 ℃、 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，加入不同濃度含油酸的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng).實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，吸棄培養(yǎng)基，PBS清洗一遍，加入10 μmol/L DCFH-DA熒光探針，37 ℃孵育20 min.吸棄探針，用PBS清洗2遍，300 μL胰酶消化細(xì)胞1000 ×g，4 ℃離心6 min.吸棄上清，加入500 μL PBS重懸，放入冰盒避光，利用流式細(xì)胞儀定量ROS水平.

2.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

在6孔板中接種H9c2心肌細(xì)胞懸液(細(xì)胞5×104個(gè)·L-1，每孔100 μL)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔.在37 ℃、 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，加入不同濃度含油酸的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng).處理終點(diǎn)時(shí)，將把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞一次，加入300 μL胰酶消化細(xì)胞，吸棄胰酶，用收集到的培養(yǎng)基將細(xì)胞輕輕吹打下來(lái)，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，1000 ×g離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS 輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)并取1×104個(gè)細(xì)胞.依據(jù)情況加入相應(yīng)的Annexin-FITC/PI/FITC結(jié)合液.室溫避光放置15 min，置于4 ℃利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況.

2.7 細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)檢測(cè)

細(xì)胞經(jīng)過(guò)油酸處理終點(diǎn)后，用冷PBS洗滌樣品，并用含有蛋白酶抑制劑混合物的緩沖液裂解(RAPA∶PMSF=100∶1， PMSF母液濃度為100 μmol/L).將裂解物在4 ℃下以14 000 ×g離心15 min.用BCA蛋白定量試劑盒定量蛋白質(zhì)濃度.通過(guò)SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)提取物并電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上.用TBS-T緩沖液中的5 %無(wú)脂牛奶封閉膜90 min，并在4 ℃下與一抗孵育過(guò)夜.用TBST洗滌后，將膜與二抗在室溫下溫育1 h.β-actin 用作內(nèi)部對(duì)照.從3次實(shí)驗(yàn)中顯示代表性印跡，并用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑拍攝圖像.

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié) 果

3.1 油酸刺激引起H9c2心肌細(xì)胞增殖抑制

通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證配制油酸的溶劑本身無(wú)毒.不同濃度油酸刺激H9c2心肌細(xì)胞72 h后，所致心肌細(xì)胞增殖率呈現(xiàn)濃度依賴性降低趨勢(shì)(圖2(a))；400 μmol/L 油酸刺激H9c2心肌細(xì)胞24、48、72 h后，所致心肌細(xì)胞增殖率呈現(xiàn)時(shí)間依賴性下降趨勢(shì)(圖2(b))，表明油酸可引起H9c2細(xì)胞增殖抑制.

3.2 油酸刺激引起H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生

為探究油酸是否會(huì)引起H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，采用DCFH-DA熒光探針利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生情況.與對(duì)照組相比，利用不同濃度的油酸刺激細(xì)胞后，可引起細(xì)胞內(nèi)ROS升高并呈濃度依賴性(圖3(a))；利用400 μmol/L 的油酸刺激細(xì)胞不同時(shí)間后，可引起細(xì)胞內(nèi)ROS升高并呈時(shí)間依賴性(圖3(b));表明油酸可引起H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生.

3.3 NADPH氧化酶抑制劑降低油酸引起H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生

為確定油酸刺激細(xì)胞后引起ROS產(chǎn)生的來(lái)源，利用總活性氧抑制劑NAC、線粒體源活性氧抑制劑 mito-TEMPO 以及NADPH氧化酶抑制劑DPI與油酸聯(lián)用，72 h后檢測(cè)細(xì)胞ROS的產(chǎn)生情況. 結(jié)果表明(圖4),1 mmol/L NAC與10 μmol/L DPI預(yù)處理0.5 h均可顯著性降低油酸引起的ROS增加，而10 μmol/L mito-TEMPO 則不能降低油酸引起的ROS增加,說(shuō)明油酸引起的H9c2細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生來(lái)源于NADPH氧化酶.

與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01.

與正常組相比，*P < 0.05，**P < 0.01.

與正常組相比，**P < 0.01；與油酸組相比，##P<0.01， NS>0.05.

3.4 NADPH氧化酶抑制劑降低油酸引起H9c2心肌細(xì)胞增殖抑制

探究NADPH氧化酶抑制劑DPI是否可逆轉(zhuǎn)油酸刺激后的細(xì)胞命運(yùn)，對(duì)DPI作用細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察與細(xì)胞活力的測(cè)定.結(jié)果表明：10 μmol/L DPI 與油酸聯(lián)用后，可明顯改善細(xì)胞狀態(tài)(圖5)，通過(guò)MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)用后可顯著降低油酸引起的細(xì)胞增殖抑制(圖6)，提示NADPH氧化酶合成的ROS參與油酸誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞增殖抑制.

圖5 DPI對(duì)油酸致H9c2心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響

與正常組相比， **P < 0.01；與油酸組相比，#P < 0.05， NS > 0.05.

3.5 NADPH氧化酶抑制劑抑制油酸引起H9c2心肌細(xì)胞凋亡

3.5.1 Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 Bcl-2 家族成員與Caspase 3剪切在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用.為確定油酸引起H9c2心肌細(xì)胞的死亡機(jī)制，利用western blot 法檢測(cè)Caspase 3 剪切、Bax、Bcl-2蛋白變化.結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，油酸可明顯增加Caspase 3 剪切水平(圖7)，同時(shí)降低了Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)水平(圖8)，提示油酸可誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡；采用DPI預(yù)處理0.5 h后可明顯降低油酸誘導(dǎo)的Caspase 3 剪切水平，并且增加了Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)變化.

與正常組相比， **P < 0.01；與油酸組相比，##P < 0.01.

與正常組相比， **P < 0.01；與油酸組相比，#P < 0.05.

3.5.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 利用早期凋亡細(xì)胞中出現(xiàn)磷脂酰絲氨酸外翻的原理進(jìn)行凋亡的檢測(cè)，利用Annexin V / PI雙染后流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定凋亡時(shí)相來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡程度.結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，油酸可引起凋亡數(shù)量明顯增加，采用DPI預(yù)處理0.5 h后可明顯降低油酸誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量(圖9、圖10)，提示NADPH氧化酶所產(chǎn)生的ROS參與油酸誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡.

4 討 論

脂毒性作為一種危險(xiǎn)因素，可對(duì)心肌細(xì)胞造成不可逆的損傷，同時(shí)導(dǎo)致心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能均發(fā)生改變，增加細(xì)胞凋亡.已有研究表明棕櫚酸可對(duì)H9c2心肌細(xì)胞造成脂毒性，并且能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17-18],而不飽和脂肪酸對(duì)心肌是否有毒性作用卻未見報(bào)道.本研究利用油酸進(jìn)行心肌脂毒性的機(jī)制探討，為糖尿病心肌病的防治提供新的思路.

圖9 DPI對(duì)油酸致H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響(3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)中代表性圖片)

與正常組相比，**P < 0.01；與油酸組相比，##P < 0.01.

研究表明，由氧化脅迫導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡是糖尿病患者非缺血性心力衰竭發(fā)生的重要原因[19].糖尿病心血管系統(tǒng)中有多種ROS來(lái)源，其中包括線粒體電子傳遞鏈，NADPH氧化酶和其他酶類.糖尿病發(fā)病過(guò)程中，糖脂代謝紊亂是引起心肌功能障礙的重要原因.已有研究表明，NADPH氧化酶在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要的作用，同時(shí)也參與由高脂誘導(dǎo)的MIN6胰島β細(xì)胞凋亡[20-21]，而NADPH氧化酶在高脂誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的作用也未見報(bào)道.本研究利用油酸刺激H9c2心肌細(xì)胞，在非靶向抗氧化劑NAC、線粒體靶向抗氧化劑mito-TEMPO以及NADPH氧化酶抑制劑DPI聯(lián)合油酸的作用下，證實(shí)了油酸致細(xì)胞氧化脅迫的源頭為NADPH氧化酶，表明了NADPH氧化酶來(lái)源的ROS介導(dǎo)了油酸的細(xì)胞毒活性.

細(xì)胞凋亡作為一種細(xì)胞程序性死亡，由眾多基因參與其調(diào)控.從糖尿病動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提示，心肌細(xì)胞凋亡在糖尿病心肌病的發(fā)展過(guò)程中具有重要的作用，其中Bcl-2家族與Caspase家族為細(xì)胞凋亡研究中的重點(diǎn)，Bcl-2作為一種抗凋亡因子，而Bax是一種促凋亡因子，正常生理狀態(tài)下Bcl-2與Bax在細(xì)胞中保持動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)細(xì)胞命運(yùn)的改變具有重要意義.Caspase家族蛋白引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)也控制著細(xì)胞凋亡過(guò)程.本研究顯示，用400 μmol/L的油酸刺激H9c2心肌細(xì)胞72 h后， Caspase 3剪切以及Bcl-2/Bax比值增加，而在NADPH氧化酶抑制劑DPI與油酸聯(lián)用下可逆轉(zhuǎn)上述結(jié)果，提示NADPH氧化酶的激活參與心肌細(xì)胞凋亡.

綜上所述，油酸刺激可抑制H9c2心肌細(xì)胞的增殖、氧化脅迫增加并誘導(dǎo)細(xì)胞走向死亡，但其確切機(jī)制尚未闡明.糖尿病的發(fā)病過(guò)程中不僅是心肌細(xì)胞受損，同時(shí)伴隨著胰島β細(xì)胞等發(fā)生凋亡[22].機(jī)體內(nèi)能量平衡極為重要，線粒體作為細(xì)胞內(nèi)能量制造中心，可維持細(xì)胞正常運(yùn)轉(zhuǎn).脂肪酸氧化的場(chǎng)所是線粒體，油酸刺激或可引起線粒體功能受損.過(guò)量脂肪酸通過(guò)β氧化產(chǎn)生大量的乙酰輔酶A，高水平的還原粒將線粒體內(nèi)膜的泛醌還原為氫醌，并產(chǎn)生大量活性氧.而高水平的ROS可直接損傷線粒體DNA，線粒體生物發(fā)生過(guò)程受到抑制，導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔打開，細(xì)胞色素C釋放到胞質(zhì)中從而引起Caspase家族引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，致使細(xì)胞凋亡.這為脂毒性損傷細(xì)胞確切機(jī)制的研究提供了新的思路.

5 結(jié) 論

高脂刺激可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生氧化脅迫損傷，并確定其發(fā)生氧化脅迫源頭為 NADPH 氧化酶.高脂刺激可引起心肌細(xì)胞增殖抑制，并呈時(shí)間與濃度依賴性的方式誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，最終致使心肌細(xì)胞走向死亡.