王小蓓,劉 慶,王秀靜,李麗霞

(煙臺大學生命科學學院,山東 煙臺 264005)

近年來,由于不合理的工業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn),海洋近海岸帶遭受較為嚴重的重金屬污染[1]．潮間帶大型海藻棲息于潮間帶這一特殊的地理位置,海水重金屬污染是其不可避免要應對的環(huán)境壓力．雙向電泳技術(shù)(two-dimensional electrophoresis,2-DE)作為蛋白質(zhì)組研究中三大核心技術(shù)之一,是廣泛用于分離蛋白質(zhì)的優(yōu)選途徑,在鑒定蛋白質(zhì)差異表達方面具有顯著優(yōu)勢[2-3]．利用蛋白質(zhì)組學對海洋生物的研究亦方興未艾[4-5],利用該技術(shù)可對在不同環(huán)境脅迫下的生物體進行比較研究,確定與處理效應相關的特異性蛋白,全面深刻地了解脅迫的各種影響．小珊瑚藻(Corallinapilulifera)棲息于潮間帶中潮帶巖礁上或石沼內(nèi),是潮間帶大型海藻的一種常見類型,具有良好的綜合應用價值[6]．本研究利用蛋白質(zhì)雙向電泳和質(zhì)譜分析技術(shù),提取正常培養(yǎng)和各濃度銅處理下的藻蛋白,通過分析藻體內(nèi)可溶性蛋白種類及表達強度的變化,剖析銅脅迫因素與蛋白表達趨勢的相關性問題,進一步在蛋白質(zhì)水平上了解海藻生理機能及代謝過程與環(huán)境條件之間的相互關系,為小珊瑚藻抗銅機制的探究及研發(fā)海洋環(huán)境的監(jiān)測途徑提供一定的理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 試驗材料

煙臺月亮灣海域采集的礁石上生長旺盛的新鮮小珊瑚藻．

1.2 試驗方法

1.2.1 材料準備 挑選生長旺盛的新鮮小珊瑚藻,迅速帶回實驗室,滅菌海水仔細洗去沉積物及附著雜質(zhì),約30 g 鮮重小珊瑚藻作為一個處理,培養(yǎng)于盛有2.5 L 滅菌海水的透明玻璃缸中,海水持續(xù)充氣并每日更換．經(jīng)過3 d預培養(yǎng)后,海藻材料接受銅脅迫處理．根據(jù)我國污水綜合排放標準規(guī)定及預實驗的結(jié)果, 設置3個銅處理濃度(一級投放標準銅濃度 0.5 mg/L 的1/2倍、1倍及2倍),將小珊瑚藻分別置于Cu2+濃度為 0.25、0.5及1.0 mg/L 的滅菌海水中培養(yǎng)．對照組置于正常滅菌海水中充氣培養(yǎng),處理組和對照組各設置3次重復．處理6 d后,為減少實驗誤差,控制實驗因素,選取長勢一致對照組和處理組的藻段,于液氮速凍后-80 ℃冷藏備用．

1.2.2 樣品蛋白質(zhì)的提取 蛋白質(zhì)的提取采用酚抽提法[7],并進行了部分改進．海藻中加入1 mL 10%預冷三氯乙酸(TCA)丙酮提取液,用細胞破碎機破碎;勻漿中加入8 mL TCA丙酮提取液,4 ℃下15 000 r/min 離心20 min,去上清加入10 mL 預冷丙酮重復上一步驟1次;冰上干燥,加入4 mL 酚抽提液(30% 蔗糖, 0.25 mol/L Tris-HCL, pH值8.0, 0.05 mol/L EDTA-Na, 0.1 mol/L KCL, 2% SDS, 0.02 mol/L 二硫蘇糖醇(DTT)),混勻;加入4 mL Tris-丙酮-酚,4 ℃下混勻1 h;4 ℃下15 000 r/min離心20 min,取上層酚層溶液于另一支15 mL離心管中;加入3倍體積的0.1 mol/L醋酸銨甲醇溶液,-20 ℃沉淀1 h;4 ℃下15 000 r/min離心20 min取沉淀,加入1 mL丙酮(含0.02 mol/L DTT),4 ℃下15 000 r/min離心10 min,重復2次．-20 ℃冰箱干燥10 min;將干燥的粉末溶于樣品裂解液中,30 ℃恒溫水浴充分溶解蛋白,加10 μL兩性電解質(zhì)(IPG buffer);室溫下15 000 r/min離心10 min取上清,并再次離心,充分去除雜質(zhì)．蛋白質(zhì)濃度測定參照Bradford[8]的方法進行．

1.2.3 蛋白質(zhì)雙向電泳 本實驗采用17 cm pH值為4～7的線型預制膠條,聚丙烯酰胺凝膠濃度為12.5%,蛋白上樣量為300 μg,各項具體操作依據(jù)Holloway and Arundel[9]的方法進行．采用考染法對凝膠進行染色,并進行下一步分析．

1.2.4 圖像采集與分析 采用透射模式分辨率300 dpi進行掃描,圖像用PDQuest Advanced 8.0.1進行分析,分別創(chuàng)建對照組和處理組進行組內(nèi)和組間分析．

1.2.5 差異蛋白質(zhì)MALDI-TOF-MS鑒定 將軟件分析確定的差異蛋白點用切膠筆手動切割下來置于1 mL離心管中,交給上海博苑基因公司進行樣品的漂洗、脫色、凍干、酶解,進行MALDI-TOF-MS鑒定,通過Mascot軟件在數(shù)據(jù)庫中進行比對．

2 結(jié)果與分析

2.1 小珊瑚藻蛋白表達譜的差異分析

Cu2+處理后小珊瑚藻藻體蛋白的雙向電泳圖譜如圖1所示．使用PDQuest Advanced 8.0.1軟件對電泳圖譜進行分析,鑒定出4組蛋白質(zhì)點數(shù)分別為220個、341個、278個及96個．當Cu2+處理濃度為0.25 mg/L時,小珊瑚藻產(chǎn)生的部分蛋白表達豐度顯著增加,樣品中的蛋白點數(shù)量亦達到頂峰;隨Cu2+處理濃度升高至0.5 mg/L,可檢測的蛋白點數(shù)目逐步減少;當Cu2+濃度達到1.0 mg/L時,蛋白點的大小和數(shù)量出現(xiàn)顯著下降,部分蛋白甚至消失,脅迫體現(xiàn)為明顯的“低促高抑”效應．

圖1 小珊瑚藻藻體蛋白雙向電泳圖譜

不同處理后小珊瑚藻相應的蛋白濃度測定值見圖2．由圖2可知,0.25 mg/L處理下蛋白濃度與對照組間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)．在最高濃度(1.0 mg/L)處理下,蛋白質(zhì)濃度與對照組相比顯著下降(P<0.05),而0.5 mg/L處理下蛋白濃度與對照組間濃度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)．

鑒于小珊瑚藻在0.25 mg/L脅迫處理后蛋白表達豐度增加最為顯著,因此選擇該處理圖譜與對照組圖譜進行了對比分析,二者在不同的分子質(zhì)量和等電點的數(shù)量分布見圖3．由圖3可見,小珊瑚藻的蛋白點均集中在分子質(zhì)量14～75 kU及等電點4.5～6.5之間,0.25 mg/L處理組的蛋白點數(shù)量在各范圍內(nèi)較對照組均有顯著增加,分布趨勢基本一致．

圖2 不同濃度銅處理下小珊瑚藻的蛋白質(zhì)濃度變化

圖3 對照組和0.25 mg/L組的蛋白點在不同分子質(zhì)量和等電點的數(shù)量分布

繼續(xù)以0.25 mg/L處理組電泳圖譜為分析模板,選擇差異大于2.5倍的點為顯著差異點,共識別49個差異蛋白,其中34個表達上調(diào),15個表達下調(diào),蛋白表達柱形圖結(jié)果見圖4．對照組與0.25 mg/L處理組中蛋白點SSP4601與蛋白點SSP4302的差異表達對比放大圖及立體圖如圖5所示．

2.2 差異蛋白點的MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果

從0.25 mg/L組差異蛋白中繼續(xù)篩選出7個豐度較高的蛋白點(圖6)進行MALDI-TOF-MS鑒定,成功鑒定出4個陽性結(jié)果(表1): ABC轉(zhuǎn)運蛋白(SSP4601),超氧化物歧化酶(SSP8401),葉綠素外在蛋白(SSP3305),保守假定蛋白(SSP4302)．這些蛋白可能通過清除活性氧、參與防衛(wèi)反應及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種方式在藻體抵御Cu2+脅迫的影響中發(fā)揮作用．

圖4 對照組和0.25 mg/L處理組的蛋白點表達量變化

圖5 對照組和0.25 mg/L處理組蛋白點的差異表達

圖6 7個差異蛋白圖譜

3 討 論

蛋白質(zhì)組學研究為后基因組時代的重要研究領域，雙向電泳作為一種簡單、高效、快速分離蛋白的方法在研究中廣泛應用．雙向電泳對蛋白質(zhì)樣品的濃度及純度要求較高,蛋白質(zhì)樣品的制備對于蛋白質(zhì)組學是否成功有著至關重要的影響[10-11]．

經(jīng)過多次預實驗的比較,本研究采用改良后的酚抽提法進行小珊瑚藻蛋白的提取,所提取的蛋白質(zhì)濃度及純度有明顯提高,鈣質(zhì)等雜質(zhì)成分顯著減少,2-DE圖譜中的蛋白點數(shù)明顯增多,橫縱條紋大幅減少,且二位圖譜背景也比較清晰．因此,改良后的酚抽提法更適合于小珊瑚藻蛋白的提取．

表1 小珊瑚藻差異蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

ABC轉(zhuǎn)運蛋白是生物體中最大的蛋白家族之一,含有1～2個接合核苷酸的域(NBDS)和跨膜域(TMD),通過形成二聚體或多聚體來實現(xiàn)功能．此類蛋白的共同點是序列上含有所謂的接合ATP的盒,這個序列盒通過與ATP的接合和解離來調(diào)節(jié)物質(zhì)的跨膜運輸[12]．ABC轉(zhuǎn)運蛋白在植物體內(nèi)對脂質(zhì)、生長素、次生代謝物和異源物質(zhì)的運輸及解毒有一定作用,尤其是在維持K+的細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)機制方面有作用．本試驗中鑒定出的該蛋白表達豐度上調(diào),說明Cu2+離子的脅迫后,小珊瑚藻細胞通過調(diào)整轉(zhuǎn)運蛋白代謝水平以維持細胞內(nèi)外的滲透壓平衡．

此外,與脂雙層疏水部分相連接的外在蛋白和光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)中葉綠體光電子的傳遞均受Cu2+的影響,當環(huán)境中Cu2+的濃度過高時會破壞PSⅡ供體位點的放氧復合體蛋白,使光反應PSⅡ的活性喪失,放氧能力也喪失[18]．AGGARWAL等報道海水中銅對藻類的光合作用的主要影響與葉綠體色素組成和超微結(jié)構(gòu)的變化、凈光合速率的降低,核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的降低有關,抑制了電子傳遞和PSⅡ的活動[19]．高政權(quán)[20]2005年報道首次在大型海洋紅藻條斑紫菜(PorphyrayezoensisUdea)PSⅡ中發(fā)現(xiàn)20 kU 蛋白．此外,在條斑紫菜葉狀體PSⅡ中還發(fā)現(xiàn)了14 kU和16 kU 2種新蛋白,但未檢測到廣泛存在于單細胞紅藻和藍藻 12 kU 蛋白,而本研究中鑒定蛋白點SSP3305為PSⅡ12 kU外在蛋白,這也是潮間帶大型紅藻小珊瑚藻中發(fā)現(xiàn)此類蛋白的首次報道,而此種外在蛋白的高級結(jié)構(gòu)組成及小珊瑚藻受到Cu2+離子脅迫時細胞內(nèi)光合生理代謝變化規(guī)律,還需要進一步的研究探索．

4 結(jié) 論

本研究表明,Cu2+能對小珊瑚藻蛋白表達產(chǎn)生顯著影響,0.25 mg/L Cu2+處理下蛋白濃度與對照間達到差異顯著水平,而在最高濃度1.0 mg/L Cu2+處理下,蛋白質(zhì)濃度比對照顯著下降,表現(xiàn)為 “低促高抑”效應;0.25 mg/L Cu2+處理組蛋白2D圖譜與對照差異最為顯著;質(zhì)譜分析鑒定出4個陽性結(jié)果,分別為ABC轉(zhuǎn)運蛋白,SOD,PSⅡ12 kU外在蛋白,保守假定蛋白．本研究通過分析Cu2+處理下小珊瑚藻蛋白種類及表達豐度的變化,解析重金屬Cu2+梯度濃度與蛋白表達的相關性,可進一步為小珊瑚藻抗銅脅迫的應激反應及外界脅迫環(huán)境條件間的互作關系研究奠定基礎．