李朋月 朱艷蘋(píng) 國(guó)旭丹 景永帥 鄭玉光 吳蘭芳

(河北中醫(yī)學(xué)院1，石家莊 050200)(河北省中藥炮制技術(shù)創(chuàng)新中心2，石家莊 050200)(河北科技大學(xué)3，石家莊 050018)

淡豆豉為豆科植物大豆Glycinemax(L.) Merr.成熟種子的發(fā)酵加工品，具有良好食用及藥用價(jià)值，可治療感冒、寒熱頭痛、煩躁胸悶、虛煩不眠的癥狀[1]。淡豆豉中含有大豆異黃酮、多糖等活性成分[2]，多糖是由醛基和酮基通過(guò)苷鍵連接的高分子聚合物，目前已經(jīng)有100多種植物多糖被分離出來(lái)應(yīng)用于臨床[3]。

研究表明，經(jīng)過(guò)酶解后的多糖生物活性得到了明顯提高。鄭嵐等[4]通過(guò)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)纖維素酶、蝸牛酶和硫酸水解的干巴菌多糖的抗氧化能力顯著增強(qiáng)。多糖酶解主要是通過(guò)改變多糖分子質(zhì)量、分子結(jié)構(gòu)、黏度及取代基的種類、數(shù)量和位置以實(shí)現(xiàn)其理化性質(zhì)的改變、生物活性的增強(qiáng)甚至獲得新的生物活性[5]；據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，植物多糖具有廣泛的生物活性，并表明多糖作為抗氧化劑具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[6]。目前鮮見(jiàn)淡豆豉多糖進(jìn)行纖維素復(fù)合酶酶解等的相關(guān)報(bào)道。

本研究主要對(duì)淡豆豉多糖進(jìn)行提取，利用纖維素復(fù)合酶進(jìn)行修飾，并測(cè)定淡豆豉多糖及其纖維素復(fù)合酶酶解產(chǎn)物的性質(zhì)及抗氧化活性，以期為淡豆豉多糖及多糖類成分的修飾和淡豆豉活性成分的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淡豆豉、纖維素復(fù)合酶：食用級(jí)；牛血清蛋白、DPPH、Trolox、AAPH、FL、考馬斯亮藍(lán)：分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

TH-500型梯度混合器，BT-100B型數(shù)顯恒流泵；UV-2550型紫外分光光度儀，3020-425型多功能微孔板讀數(shù)儀，1260型高效液相色譜儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 淡豆豉預(yù)處理

取淡豆豉，粉碎，過(guò)40目篩，用95%乙醇回流提取2 h，除去脂溶性成分，藥渣干燥后，備用。

1.3.2 淡豆豉多糖的提取

取除脂后的淡豆豉粉末，加入20倍體積的蒸餾水提取，在超聲波輔助的條件下，55 ℃恒溫提取22 min，離心取上清液。淡豆豉殘?jiān)貜?fù)提取1次，合并濾液。將濾液減壓濃縮至一定體積，使用終濃度為80%的乙醇沉淀，抽濾，濾渣揮去酒精后冷凍干燥，得到淡豆豉粗多糖(SSPP)。

1.3.3 淡豆豉多糖的酶解

采用恒溫?fù)u床法進(jìn)行酶解，精密稱取2 g淡豆豉多糖，放入具塞錐形瓶中，加純水?dāng)嚢柚寥芙?，調(diào)pH至中性，加12%的纖維素復(fù)合酶至溶解，在55 ℃恒溫?fù)u床中反應(yīng)1 h。

反應(yīng)后沸水浴滅活10 min，離心，取上清液用終濃度為80%乙醇進(jìn)行醇沉，4 ℃靜置24 h，抽濾，濾渣揮去酒精后冷凍干燥，得到纖維素復(fù)合酶酶解產(chǎn)物SSPP-E。

1.3.4 淡豆豉多糖及其酶解產(chǎn)物糖含量的測(cè)定

采用硫酸-苯酚法測(cè)定可溶性總糖含量。參照文獻(xiàn)[7]方法進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按該方法在490 nm處測(cè)定樣品的吸光度值，并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可溶性糖含量[8]。

1.3.5 淡豆豉多糖及其酶解產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

參照文獻(xiàn)利用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定SSPP及SSPP-E中蛋白質(zhì)含量[8]。

1.3.6 淡豆豉多糖及其酶解產(chǎn)物的紫外-可見(jiàn)光譜分析

精確稱取SSPP及SSPP-E樣品各1.0 mg，用少量蒸餾水溶解，定容至10 mL的容量瓶中，使其配成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的多糖溶液，在200～800 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描[9]。檢測(cè)多糖中是否具有核酸和蛋白質(zhì)的特征吸收峰。

1.3.7 淡豆豉多糖及其酶解產(chǎn)物的紅外光譜分析

精確稱取1.0 mg的SSPP及SSPP-E樣品，以KBr混合研磨成極細(xì)粉末，壓片，在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描[10]。檢測(cè)樣品中是否存在多糖的特征吸收峰。

1.3.8 淡豆豉多糖及其酶解產(chǎn)物的單糖組成分析

參照文獻(xiàn)對(duì)淡豆豉多糖及其酶解產(chǎn)物的單糖組成進(jìn)行測(cè)定[11,12]。

1.3.9 淡豆豉多糖及其酶解產(chǎn)物的抗氧化活性測(cè)定

1.3.9.1 DPPH活性的測(cè)定

參照Karagozler A A等[13]的方法。

1.3.9.2 羥基自由基的測(cè)定

參考許效群等[14]方法。將每個(gè)樣品濃度平行測(cè)定3次，計(jì)算平均值，通過(guò)式(1)計(jì)算清除率：

(1)

式中：K為清除率/%；A1為多糖樣品的吸光度；A2為本底吸光度；A0為空白對(duì)照的吸光度。

1.3.9.3 ORAC的測(cè)定

參考Lin Lianzhu等[15]方法進(jìn)行測(cè)定。ORAC實(shí)驗(yàn)需要設(shè)定兩種對(duì)照，即沒(méi)有添加AAPH的FL熒光自然衰減對(duì)照和沒(méi)有抗氧化劑存在時(shí)的AAPH作用對(duì)照。

樣品的抗氧化能力與自由基作用下熒光衰退曲線的延緩部分面積(Net AUC)直接相關(guān)[16]，計(jì)算ORAC值。

(2)

2 結(jié)果

2.1 淡豆豉多糖的提取率

除脂后的淡豆豉粉末經(jīng)超聲波輔助水提后，用乙醇沉淀，沉淀干燥得到淡豆豉粗多糖(SSPP)，提取率為4.59%。

2.2 淡豆豉多糖的酶解得率

取2 g的SSPP通過(guò)纖維素復(fù)合酶進(jìn)行恒溫?fù)u床酶解，得到SSPP-E，酶解得率為58.0%。

2.3 可溶性總糖含量測(cè)定

以葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)曲線得回歸方程為y=12.1x+0.151 6 (R2=0.992 7)，通過(guò)計(jì)算可得，SSPP和SSPP-E可溶性總糖含量分別為68.88%和55.08%。

2.4 蛋白含量的測(cè)定

以牛血清蛋白做標(biāo)準(zhǔn)品，得方程y=7.312 9x+0.703 5 (R2=0.992 0)，SSPP和SSPP-E的蛋白含量分別為4.03%和0.19%。

2.5 紫外-可見(jiàn)光譜分析

由圖1可知，吸收峰主要在260～280 nm之間，說(shuō)明SSPP、SSPP-E內(nèi)可能含有少量蛋白質(zhì)或核酸等成分，和蛋白測(cè)定結(jié)果相一致。

圖1 SSPP和SSPP-E的紫外-可見(jiàn)光譜結(jié)果圖

2.6 紅外光譜分析

圖2 SSPP和SSPP-E紅外光譜結(jié)果圖

2.7 SSPP和SSPP-E的單糖組成分析

為了進(jìn)一步研究酶解前后的單糖組成變化，采用PMP衍生化HPLC法進(jìn)行單糖組成測(cè)定。

根據(jù)圖3～圖5可知，SSPP單糖組成的摩爾比∶甘露糖∶葡萄糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶木糖∶阿拉伯糖為0.05∶0.14∶0.13∶0.26∶0.18∶0.24；SSPP-E單糖組成的摩爾比∶甘露糖∶葡萄糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶木糖∶阿拉伯糖為0.08∶0.18∶0.12∶0.18∶0.21∶0.23。從單糖組成來(lái)看，組成SSPP和SSPP-E的單糖組成一致，但是單糖的摩爾比發(fā)生了變化，甘露糖、葡萄糖、木糖的含量增加，葡萄糖、半乳糖含量減小，阿拉伯糖量基本不變。這可能是因?yàn)樵诿附庑揎椷^(guò)程中，一些支鏈從糖鏈上斷裂，導(dǎo)致單糖比例發(fā)生變化。

注：1 甘露糖；2 鼠李糖；3 半乳糖醛酸；4 葡萄糖醛酸；5 葡萄糖；6 半乳糖；7 木糖；8 阿拉伯糖；9 果糖。圖3 標(biāo)準(zhǔn)品的PMP衍生物HPLC圖譜

注：1 露糖；2 葡萄糖醛酸；3 葡萄糖；4 半乳糖；5 木糖；6 阿拉伯糖。圖4 SSPP的PMP衍生物HPLC圖譜

注：1 甘露糖；2 葡萄糖醛酸；3 葡萄糖；4 半乳糖；5 木糖；6 阿拉伯糖。圖5 SSPP-E的PMP衍生物HPLC圖譜

2.8 淡豆豉多糖及酶解產(chǎn)物的抗氧化活性測(cè)定

2.8.1 清除DPPH自由基活性

由圖6可知，在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，樣品質(zhì)量濃度和清除率成一定的量效關(guān)系。在濃度為4 mg/mL時(shí)SSPP清除率為41.95%，SSPP-E的清除率為55.20%。通過(guò)計(jì)算IC50值得出，SSPP的IC50值為4.842 mg/mL，SSPP-E的IC50值為3.574 mg/mL，通過(guò)方差分析表明P<0.001，具有極顯著差異，說(shuō)明酶解有利于提高淡豆豉多糖清除DPPH自由基的活性。

圖6 SSPP和SSPP-E清除DPPH自由基活性結(jié)果圖

2.8.2 清除羥基自由基的活性

由圖7可知，在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，樣品質(zhì)量濃度和清除率成正比關(guān)系，各樣品均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。濃度為1.8 mg/mL時(shí)，SSPP的清除率為82.52%，SSPP-E為84.22%。田崇梅等[18]在黃芪多糖體外抗氧化性研究中得出當(dāng)蒙古黃芪多糖的質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)其清除率為85%，其研究與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相差不大。通過(guò)計(jì)算IC50值得出，SSPP的IC50值為1.099 mg/mL，SSPP-E的IC50值為1.041 mg/mL，通過(guò)方差分析無(wú)顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明在清除羥基自由基的活性時(shí)，淡豆豉多糖酶解產(chǎn)物與未酶解組差異不大。

圖7 SSPP和SSPP-E清除羥基自由基活性結(jié)果圖

2.8.3 ORAC的測(cè)定

對(duì)ORAC測(cè)定運(yùn)用統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 8.0軟件作圖分析。

圖8 不同濃度的Trolox熒光衰退動(dòng)力學(xué)曲線圖

通過(guò)計(jì)算不同摩爾濃度的Trolox與凈AUC值之間的線性關(guān)系得到方程：y=0.312 4x-1.625 9(R2=0.995 2)，由結(jié)果可知標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)性較高。

表1 SSPP和SSPP-E的ORAC值

由表1可以看出，酶解后有利于ORAC值的升高，在樣品質(zhì)量濃度為0.005 mg/mL時(shí)，SSPP和SSPP-E的ORAC值分別為1 492.16和2 123.90 μmol TE/g，方差分析表明P<0.001，具有極顯著差異，從結(jié)果可以看出，酶解有利于淡豆豉多糖氧自由基吸收能力的提高。

通過(guò)抗氧化活性測(cè)定結(jié)果表明：SSPP經(jīng)過(guò)酶解后，其抗氧化活性得到增強(qiáng)。

3 結(jié)論

通過(guò)提取淡豆豉多糖，并對(duì)其進(jìn)行酶解，通過(guò)比較酶解前后的理化性質(zhì)及體外抗氧化活性得出：1)SSPP和SSPP-E均具有多糖的典型特征吸收峰，經(jīng)過(guò)酶解后，SSPP-E的可溶性總糖含量、蛋白含量、單糖組成的摩爾比發(fā)生了變化。2)經(jīng)過(guò)酶解后，體外抗氧化活性得到一定程度的提高。

淡豆豉多糖經(jīng)過(guò)酶解后其體外活性有所提高，可能是因?yàn)椴糠值鞍妆怀?，暴露了更多的活性基團(tuán)(如葡萄糖醛酸或其他結(jié)合的小分子化合物)，或者是酶解使得淡豆豉降解為分子質(zhì)量較低的多糖，分子質(zhì)量減小之后有利于多糖空間結(jié)構(gòu)的舒展和與自由基的結(jié)合，提高抗氧化的能力，但具體的性質(zhì)與活性之間的關(guān)系如何，有待進(jìn)一步研究。