王鳳軍 葉素丹 凌 云 周曉紅

(浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，杭州 310012)

《2017年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢》報告顯示全球轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化種植面積達到了1.898億公頃，創(chuàng)歷史新高，從1996年到2017年，全球轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物商業(yè)化22年間，種植面積增長了約112倍。自1992年以來全球67個國家/地區(qū)的監(jiān)管機構(gòu)批準(zhǔn)了來自先正達、孟山都、巴斯夫和柯迪華等跨國農(nóng)業(yè)生物技術(shù)公司的4 133項監(jiān)管審批，涉及26個轉(zhuǎn)基因作物的476個轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體。其中，1 995項食用，1 338項飼用，800項用于種植或環(huán)境釋放[1]。從全球轉(zhuǎn)基因作物種植品種來看，主要以大豆、玉米、棉花、油菜四大作物為主，其中轉(zhuǎn)基因玉米2017年種植面積為3 384萬公頃，占全球轉(zhuǎn)基因種植面積的45.1%，是種植面積第二大的作物。目前全球轉(zhuǎn)基因玉米共146個品系，主要有耐除草劑、抗蟲、改善品質(zhì)、耐旱及抗蟲+耐除草劑、品質(zhì)和耐除草劑等轉(zhuǎn)基因性狀[2]。

2018年，美國、阿根廷、澳大利亞、巴西、加拿大等13個國家簽署了關(guān)于推進精準(zhǔn)生物技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用的聯(lián)合聲明，就基因編輯農(nóng)作物采取一致和可靠的措施。我國已批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)應(yīng)用安全證書并在有效期內(nèi)的作物有棉花、水稻、玉米和番木瓜，但進行商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物僅有棉花和番木瓜。中國批準(zhǔn)進口用作加工原料的轉(zhuǎn)基因作物大豆、玉米、油菜、棉花和甜菜等均需獲得我國的安全證書。我國制定的《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物進口安全管理辦法》《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物加工審批辦法》等，規(guī)定轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識的監(jiān)督管理及標(biāo)識檢查驗證[3,4]。

轉(zhuǎn)基因作物給人們帶來了優(yōu)良的性狀，解決了糧食短缺問題，但也存在潛在的安全性，如生態(tài)系統(tǒng)破壞、自然資源庫污染、新型病原體產(chǎn)生和外來物種的侵入以及人類健康危險等[5-7]。因此有必要對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的進行外源基因檢測，控制未批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的流通。為提高檢測準(zhǔn)確性和時效性，主要以實時熒光PCR和數(shù)字PCR為主[8-15]。Michaela H?hne等[16]應(yīng)用實時熒光PCR對轉(zhuǎn)基因玉米Bt11、Bt176、 Mon810和T25 品系中的35S-CaMV外源基因進行檢測。梁文等[17]使用數(shù)字PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)基因玉米MON89034、MON810、MIR162中的品系特異性基因片段和內(nèi)源基因進行定量分析。

本研究通過多重引物和熒光探針組合篩選，反應(yīng)體系優(yōu)化，特異性、重復(fù)性和靈敏性測試以及樣品適用性檢測等過程開發(fā)建立了四重?zé)晒舛縋CR檢測技術(shù)。該技術(shù)的使用可實現(xiàn)一個反應(yīng)管中同時檢測兩個靶標(biāo)基因，降低試劑成本，縮短檢測時間，提高檢測效率，為玉米及其深加工產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分的快速檢測提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

10% MON810、10%Bt11、100% MON863、Bt176、GA21轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)品；CNAS T025-24/30、CNAS T0659-23/74/79/104/175、ACAS-T067-J273/J213，F(xiàn)APAS GeMSU 56A/56B均為中國合格評定國家認(rèn)可委員會(CNAS)/英國食品與環(huán)境研究院(FAPAS)能力驗證樣品；松仁玉米、甜糯玉米、玉米酥和爆米花等26種玉米及其深加工制品均為市售。

1.2 試劑

植物DNA提取試劑盒(69104)、 SureFood PREP Plant X(S1006)、TransStart Probe qPCR SuperMix(AQ401-02)，探針與引物委托機構(gòu)合成。

1.3 方法

1.3.1 核酸樣本制備

稱取玉米粉、玉米片、玉米糝等干重樣品40 mg或玉米汁、玉米餅和玉米米酒等濕重樣品150 mg，按照基因組DNA提取試劑盒說明書進行操作，非粉末樣品使用液氮研磨或勻漿器進行破碎30 s，其中洗脫液使用滅菌雙純水50 μL。玉米深加工制品采用試劑盒進行操作。樣品提取后使用RNA酶對RNA進行降解，再使用NanoDrop-one核酸蛋白分析儀測試DNA的含量和純度。

1.3.2 引物和探針設(shè)計

采用國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(ISAAA)轉(zhuǎn)基因批準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫檢索轉(zhuǎn)基因玉米批準(zhǔn)商業(yè)化種植品系及轉(zhuǎn)化事件，分析各類轉(zhuǎn)化事件被轉(zhuǎn)入的外源基因，選定花椰菜花葉病毒35S啟動子(pCaMV35S)、農(nóng)桿菌的胭脂堿合成酶基因終止子(tNOS)以及根癌農(nóng)桿菌CP4蛋白基因和5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPS)為外源基因，選定編碼玉米淀粉合成酶異構(gòu)體zSTSII-2 (zSSIIb) 基因作為玉米物種的內(nèi)參照基因。使用Primer 5.0軟件和Peimer-BLAST設(shè)計多重引物和熒光探針。熒光探針報告基團按照設(shè)備性能以及波長范圍，設(shè)置NED、VIC、FAM和Cy5為報告基團，采用非熒光淬滅基團進行熒光信號收集，其中VIC和NED采用MGB分子信標(biāo)熒光探針。

1.3.3 單重?zé)晒釶CR反應(yīng)

反應(yīng)體系為20 μL，在200 μL光學(xué)PCR反應(yīng)管中依次加入：Nuclease-free蒸餾水1.2 μL，TransStart Probe qPCR SuperMix (2×) 10 μL，Passsive Reference Dye II(50×) 0.4 μL，引物(10 μmol/L)0.4 μL、探針(10 μmol/L)0.2 μL和擴增模板1 μL。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s共兩步法，其中第二步設(shè)置40個循環(huán)。在ABI QuantStudio Q5實時熒光PCR儀進行擴增反應(yīng)。每個基因設(shè)置3個平行實驗，每次檢測設(shè)置以轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板的陽性對照，以已知非轉(zhuǎn)基因玉米樣品為陰性對照，以及提取空白對照和PCR反應(yīng)空白對照。

1.3.4 多重?zé)晒釶CR反應(yīng)

反應(yīng)體系為20 μL, 在多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系加入4組檢測引物和探針，TransStart Probe qPCR SuperMix，Passsive Reference Dye II和基因組DNA等成分(具體見表1)，熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù)同1.3.3。使用QuantStudioTMDesign & Analysis software進行數(shù)據(jù)分析和處理。

表1 四重?zé)晒舛縋CR的反應(yīng)混合液組成

1.3.5 引物探針特異性檢測

提取ACAS-T067-J273轉(zhuǎn)基因玉米樣本以及非轉(zhuǎn)基因玉米粉樣本基因組DNA，使用1.3.3單重實時熒光PCR體系進行擴增，確定樣品中目標(biāo)外源基因，確?；蚪MDNA提取的有效性。按照1.3.4四重?zé)晒舛縋CR體系進行多重檢測，驗證4個基因之間在多重?zé)晒夥磻?yīng)體系中的熒光信號是否有干擾。

1.3.6 靈敏性檢測

提取ACAS-T067-J273轉(zhuǎn)基因玉米樣本基因組DNA，按照10倍濃度稀釋5個梯度，稀釋介質(zhì)為Nuclease-free dd H2O。根據(jù)玉米的單倍體基因組分子質(zhì)量約為2.6 pg。稀釋后標(biāo)準(zhǔn)品每個反應(yīng)分別為13 000、1 300、130、13、1.3拷貝。以5個梯度的標(biāo)準(zhǔn)品分別為模版，進行四重實時熒光定量反應(yīng)，每個濃度設(shè)置3個重復(fù)，驗證方法的靈敏性和檢測范圍。以拷貝數(shù)的自然對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)繪制內(nèi)源基因zSSIIb和外源基因pCaMV35S、tNOS和EPSPS的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線性方程，相關(guān)系數(shù)和擴增效率。

1.3.7 適用性檢測

對農(nóng)貿(mào)市場、超市等流通的玉米產(chǎn)品及其深加工制品以及實驗室收集的各種轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)品，能力驗證樣品以及轉(zhuǎn)基因大豆、棉花、番茄等轉(zhuǎn)基因陽性樣品進行四重實時熒光PCR反應(yīng)，篩查檢測是否含有pCaMV35S、tNOS和EPSPS外源基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 核酸樣本制備結(jié)果

用核酸蛋白分析儀測定基因組DNA的質(zhì)量和濃度，所有材料的基因組DNA OD260/OD280的比值大多為1.6～2.0，經(jīng)測試其濃度為50～250 ng/μL，符合熒光PCR擴增要求，統(tǒng)一稀釋成100 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 引物和探針特異性檢測

按照1.3.2中的方法針對轉(zhuǎn)基因玉米內(nèi)參照基因zSSIIb和外源基因pCaMV35S、tNOS和EPSPS引物和多重?zé)晒馓结?，序列見?。

表2 轉(zhuǎn)基因玉米特異性檢測的引物和探針序列

2.3 特異性檢測結(jié)果

提取轉(zhuǎn)基因玉米ACAS-T067-J273和非轉(zhuǎn)基因玉米ZY1711樣本基因組DNA，使用上述多重?zé)晒舛縋CR體系進行轉(zhuǎn)基因成分檢測，驗證方法的特異性。圖1為轉(zhuǎn)基因玉米ACAS-T067-J273和非轉(zhuǎn)基因玉米ZY1711多重反應(yīng)的結(jié)果，內(nèi)源基因zSSIIb均產(chǎn)生了明顯的S型擴增曲線，Ct值小于35。外源基因pCaMV35S、tNOS和EPSPS在轉(zhuǎn)基因玉米中檢出，且擴增曲線呈現(xiàn)明顯的S型，而非轉(zhuǎn)基因玉米中不檢出，空白對照無信號，檢測基因之間無信號干擾，外源基因的反應(yīng)結(jié)果與期望結(jié)果一致，表明引物探針的設(shè)計及反應(yīng)體系的設(shè)置具有特異性，可用于玉米轉(zhuǎn)基因成分的篩查檢測。

圖1 外源基因pCaMV35S、tNOS和EPSPS以及內(nèi)源基因zSSIIb四重?zé)晒釶CR反應(yīng)的擴增曲線圖

2.4 重復(fù)性和靈敏性檢測

轉(zhuǎn)基因玉米ACAS-T067-J273梯度稀釋后DNA四重實時熒光PCR擴增的Ct值見表3所示，四個基因相關(guān)系數(shù)R2為0.992～0.996。同一基因同一稀釋梯度范圍內(nèi)Ct值的變異系數(shù)較小，重復(fù)性較好。zSSIIb基因Ct值變化范圍在19.26～34.39之間，標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.048～0.837，R2為0.993，擴增效率為96.1%；外源基因pCaMV35S的Ct值變化范圍在22.70～37.68，標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.082～0.605，R2為0.992，

表3 轉(zhuǎn)基因玉米多重?zé)晒舛縋CR靈敏性檢測Ct值分析表

擴增效率為104%；外源基因tNOS的Ct值變化范圍在24.01～37.83，標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.160～0.876，R2為0.996，擴增效率為97.2%，外源基因EPSPS的Ct值變化范圍22.84～37.45，標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.054～0.704，R2為0.996，擴增效率為91.4%，表明該四重實時熒光PCR擴增體系穩(wěn)定性較高，重復(fù)性較好，最低檢測限為每20 μL反應(yīng)1.3個拷貝，最低定量限為每20 μL反應(yīng)13個拷貝。

2.5 樣品檢測結(jié)果

對購自農(nóng)貿(mào)市場的松仁玉米、甜糯玉米、玉米酥和爆米花等26種玉米及其深加工制品等樣品以及轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)品和能力驗證樣品進行四重實時熒光PCR檢測，同時按照SN/T 1204—2016《植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分 實時熒光PCR定性檢測方法》中所述的引物和探針、檢測步驟和反應(yīng)程序?qū)悠愤M行檢測[18]，結(jié)果見表4。經(jīng)SN/T 1204—2016標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系驗收和盲樣測試的10個轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)品和能力驗證樣品四重實時熒光PCR反應(yīng)均為陽性，26個市場抽樣的玉米制品分別經(jīng)四重實時熒光PCR檢測和標(biāo)準(zhǔn)方法檢測，均為陰性。表明本實驗研究開發(fā)的四重實時熒光PCR反應(yīng)體系適用于玉米轉(zhuǎn)基因成分的篩查檢測，尤其是大量樣本的快速檢測。

表4 四重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)對轉(zhuǎn)基因玉米、大豆標(biāo)準(zhǔn)品和CNAS/FAPAS能力驗證樣品的篩查檢測結(jié)果

續(xù)表4

3 討論

目前我國已批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)應(yīng)用安全證書并在有效期內(nèi)的轉(zhuǎn)基因玉米品系共21種，主要轉(zhuǎn)入了抗蟲、抗除草劑，改良α-淀粉酶、甘露糖代謝等外源基因，見表5。通過數(shù)據(jù)庫中各轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)品中轉(zhuǎn)入的外源基因信息，以及國內(nèi)外已報道的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品抗蟲、抗病、抗除草劑和耐儲等相關(guān)基因的序列以及轉(zhuǎn)基因啟動子/終止子序列，選擇3～4個常用的外源基因和內(nèi)源基因作為靶標(biāo)基因。對靶標(biāo)基因特定序列設(shè)計引物和熒光探針，用不同報告基團(不同顏色的熒光信號)標(biāo)記，通過發(fā)射波長篩選最佳的報告集團的組合，合成后用于多重?zé)晒舛縋CR，根據(jù)其擴增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴增效率，篩選出最適合的3～4對引物和探針用于多重?zé)晒舛糠治觥?/p>

為降低多重反應(yīng)中目標(biāo)基因間的熒光信號干擾，通過十字交叉法和棋盤法優(yōu)化熒光PCR反應(yīng)參數(shù)(包括體系中Mg2+、引物、探針和模板濃度)，建立多重實時熒光定量PCR檢測技術(shù)。使用陽性對照樣品或陽性質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，進行準(zhǔn)確性和靈敏性的實驗比對分析，確定多重?zé)晒舛縋CR體系中各基因的線性檢測范圍，分析檢測靈敏度和重復(fù)性，進行多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系的方法學(xué)驗證。

表5 國內(nèi)已批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)應(yīng)用安全證書并在有效期內(nèi)的的轉(zhuǎn)基因玉米品系及相關(guān)信息

各品牌的熒光定量PCR儀的通道和提供的檢測光譜范圍的差異，決定了在選擇探針的發(fā)光基團和淬滅基團時要根據(jù)所用儀器型號設(shè)進行設(shè)置。本研究使用QuantStudio Q5實時熒光PCR儀，含有FAM/SYBR GreenI，VIC/HEX/CY3，ROX/Texas Red，Cy5，TAMARA等5色熒光檢測通道，可實現(xiàn)同一個反應(yīng)孔中同時對多個外源基因進行檢測，節(jié)省試劑耗材成本，操作簡易，尤其適合多樣品的檢測分析。

4 結(jié)論

本實驗基于四重?zé)晒釶CR 技術(shù)，通過多重引物和探針篩選，反應(yīng)條件優(yōu)化，方法學(xué)驗證等，建立了可同時對pCaMV35S、tNOS和EPSPS三 個外源基因和 zSSIIb 玉米內(nèi)參照基因進行檢測的體系。檢測體系通過各類標(biāo)準(zhǔn)品和市場抽樣樣本進行適應(yīng)性驗證，檢測結(jié)果與SN/T 1204—2016標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果一致，檢測方法具有較好的準(zhǔn)確性和可靠性，適用于農(nóng)作物種子品系溯源、食品原料玉米成分轉(zhuǎn)基因元件檢測，對玉米及其深加工制品產(chǎn)品市場的轉(zhuǎn)基因成分標(biāo)識制度的完善，規(guī)范轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的市場監(jiān)管，確保食品安全有重要意義。