王 芳 林潔茹 單姝婷 潘佳佳 王夢(mèng)瑤 鄧 剛

(浙江省特色經(jīng)濟(jì)植物生物技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院1，金華 321004)(浙江師范大學(xué)行知學(xué)院理學(xué)院2，蘭溪 321100)

香樟(Cinnamomumcamphora)，起源于中國(guó)南部、越南和日本等地[1]，是一種廣泛分布于亞洲東部、大洋洲和太平洋諸島的大型常綠喬木[2]。香樟在中國(guó)是重要的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種和城市綠化樹(shù)種之一，種植面積已達(dá)5萬(wàn)多公頃[3]。按每年修枝率5%計(jì)算，僅一個(gè)中型城市修剪產(chǎn)生的枝葉可達(dá)3萬(wàn)t[4]，其中部分被廢棄，但主要可用于精油的提取。從香樟枝葉中提取的精油富含萜類(lèi)化合物，其中芳樟醇、桉葉油素、萜品醇等是精油的主要成分[5]，具有抗菌[6-8]、抗氧化[9]、殺蟲(chóng)[10]等生物活性，作為重要的生產(chǎn)生活資源，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、食品、香精香料等行業(yè)。

目前，香樟精油最常用的提取方法為水蒸氣蒸餾法，精油得率約1%～2%，但蒸餾時(shí)間長(zhǎng)，提取溫度高，系統(tǒng)開(kāi)放，易造成活性成分損失[11]。不同于水蒸氣提取的蒸餾原理，有機(jī)溶劑提取是根據(jù)各組分溶解性的差異，該法用于香樟精油的提取，得率可達(dá)4%[12]，但精油中含有非揮發(fā)性成分，且存在有機(jī)溶劑殘留。隨著人們對(duì)天然產(chǎn)品及食品安全性的日益關(guān)注，基于超臨界流體的綠色提取技術(shù)已成為了研究熱點(diǎn)。其中CO2作為最常用的提取劑，具有超臨界條件溫和、無(wú)殘留、成本低等特點(diǎn)[13]，但由于超臨界二氧化碳流體極性范圍窄，溶解能力有限，主要適用于低極性的親脂性活性成分的提取，因此，近年來(lái)出現(xiàn)了另一種新型的綠色溶劑二氧化碳膨脹乙醇(CO2-Expanded Ethanol, CXE)[14]。它是以乙醇為主體，加入少量壓縮CO2，使其溶解在乙醇中，從而形成的流體。通過(guò)改變CO2和乙醇的比例，使得流體的極性范圍更廣，溶解能力更高，已被廣泛用于熱敏性及易氧化物質(zhì)的提取[15]，本實(shí)驗(yàn)室也采用CXE完成了對(duì)微藻油脂[16]及香根草精油[17]的提取。本次研究將嘗試采用CXE技術(shù)對(duì)香樟葉中的精油進(jìn)行提取，通過(guò)測(cè)定精油的化學(xué)成分及抗氧化、抗菌活性，并與傳統(tǒng)提取方法進(jìn)行對(duì)比，從而評(píng)估新工藝的特點(diǎn)及可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

香樟鮮葉在2018年10月采摘于浙江省金華市(29°04′N(xiāo)，119°38′E，海拔70 m)，洗凈后于室溫下陰干24 h。干燥后的枝葉剪成碎片并用液氮研磨成粉末，-20 ℃密封保存。

抑菌活性測(cè)定的菌種包括：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus, ATCC No. 29213)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis, ATCC No. 14579)、大腸桿菌(Escherichiacoli, ATCC No. 8739)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa, ATCC No. 27853)、黑曲霉(Aspergillusniger, ATCC No. 16888)和白色念珠菌(Candidaalbicans, ATCC No. 10231)，均由浙江師范大學(xué)菌種保藏中心保藏。

1.2 儀器與試劑

HELIX超臨界天然產(chǎn)物萃取系統(tǒng)，K-501雙活塞往復(fù)泵，7820A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，BSA224S電子天平，D-1自動(dòng)控制壓力蒸汽滅菌鍋；SW-CJ-1FD潔凈工作臺(tái)；ZQZY-70BS振蕩培養(yǎng)箱。

CO2氣體(純度≥99.9%)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-3-乙苯-二噻唑-6磺酸(ABTS)、過(guò)硫酸鉀(K2S2O8)、二甲基亞砜(DMSO)、慶大霉素、兩性霉素B；二氯甲烷、環(huán)己酮為色譜純；乙醇等其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 香樟精油的提取方法

二氧化碳膨脹乙醇提?。悍Q(chēng)取50 g香樟葉粉末，與等體積玻璃珠混合均勻，置于萃取釜中。設(shè)定萃取釜的溫度為40 ℃；壓力為7 MPa，乙醇通過(guò)雙活塞往復(fù)泵以5 mL/min的流速泵入，二氧化碳則由柱塞泵加壓，流速為0.6 L/min，經(jīng)混合器和乙醇混合形成CXE流體進(jìn)入萃取釜內(nèi)，對(duì)物料進(jìn)行連續(xù)提取。每隔30 min由分離釜底部收集香樟葉精油乙醇混合液，在絕對(duì)壓力0.01～0.05 MPa，溫度45～55 ℃的條件下減壓蒸發(fā)，去除乙醇后，得到香樟葉精油。

超臨界二氧化碳提?。翰捎孟嗤难b置。稱(chēng)取50 g香樟葉粉末，加入等體積玻璃珠，置于萃取釜中。分別設(shè)置萃取釜的溫度為50 ℃，壓力為25.5 MPa，二氧化碳流速為0.6 L/min，提取時(shí)長(zhǎng)共90 min。

水蒸氣蒸餾提?。簩?0 g的香樟葉粉末按照1∶4的料液比裝入水蒸氣蒸餾裝置中，蒸餾提取2 h，停止加熱后，待提取器靜置分層，取上層油狀物質(zhì)，加入適量無(wú)水硫酸鈉干燥，制備得到的精油保存在棕色玻璃瓶中，置于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存。

有機(jī)溶劑提?。悍Q(chēng)取30 g香樟葉粉末，以乙醚為溶劑，采用索氏提取法，在55 ℃下抽提4 h。提取結(jié)束后，通過(guò)減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醚，稱(chēng)重，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 香樟精油的組成及含量分析

采用GC-MS對(duì)4種提取方法所得的香樟精油進(jìn)行成分分析。色譜條件：毛細(xì)管柱為HP-5 ms (30 m×0.25 mm×0.10 μm)；載氣為高純氦氣(純度>99.99%)，流速1 mL/min。樣品用二氯甲烷進(jìn)行稀釋?zhuān)w積分?jǐn)?shù)為1%，進(jìn)樣量為1 μL，分流比1∶50。進(jìn)樣溫度和檢測(cè)溫度分別設(shè)置為250、280 ℃。采用程序升溫：初溫50 ℃，保持3 min；然后以5 ℃/min升溫至200 ℃，保持5 min；再以2 ℃/min升溫至220 ℃，保持2 min。質(zhì)譜條件：電子能量為70 eV，掃描范圍40～400 amu，掃描速率3.99 scans/s，溶劑延遲2 min。將揮發(fā)性物質(zhì)的質(zhì)譜和保留指數(shù)與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)(WILEY10, NIST2017)以及文獻(xiàn)報(bào)道中的化合物和進(jìn)行比較，從而對(duì)香樟精油的成分進(jìn)行鑒定；以環(huán)己酮作為內(nèi)標(biāo)物，通過(guò)氣相色譜對(duì)各組分進(jìn)行了定量分析。

1.3.3 抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

分別移取50 μL 20 mg/mL的乙醇精油溶液與50 μL 0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液混合均勻，避光反應(yīng)30 min后，采用酶標(biāo)儀在517 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)X, DPPH。DPPH自由基清除率計(jì)算如下：

式中：AX, DPPH為乙醇對(duì)照組。

1.3.3.2 ABTS自由基清除能力的測(cè)定

將7 mmol/L ABTS儲(chǔ)備液和2.45 mmol/L K2S2O8儲(chǔ)備液等體積混合均勻，在室溫下避光靜置12～16 h，得到ABTS自由基母液。用乙醇稀釋母液，734 nm處測(cè)得吸光度值約為0.7±0.05，稀釋后的溶液為ABTS工作液。分別移取50 μL 20 mg/mL的乙醇精油溶液與50 μL已配置好的ABTS工作液混合均勻，避光反應(yīng)30 min后，采用酶標(biāo)儀在734 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)X, ABTS。ABTS自由基清除率計(jì)算如下：

式中：A0, ABTS為乙醇對(duì)照組。

采用方差分析法，分別對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基的清除率結(jié)果進(jìn)行顯著性分析，當(dāng)P<0.05時(shí)具有顯著性差異。

1.3.4 抑菌活性測(cè)定

采用微量稀釋法測(cè)定4種香樟精油對(duì)兩種革蘭氏陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)和兩種革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、綠膿桿菌)的最小抑菌濃度(MIC)。配制1%的DMSO精油樣品溶液，開(kāi)始時(shí)在96孔板第一行每孔中加分別加入50 μL的各精油樣品和50 μL的MH肉湯培養(yǎng)基(Mueller Hinton broth)，后續(xù)每行按照1∶1的比例進(jìn)行稀釋。以慶大霉素為陽(yáng)性對(duì)照，DMSO為陰性對(duì)照，每孔中均加入50 μL濃度約為1.5×108CFU/mL的測(cè)試菌菌懸液。96孔板在37 ℃下培養(yǎng)24 h后，檢測(cè)610 nm處的菌懸液濁度，最終的MIC濃度為無(wú)渾濁度時(shí)的精油樣品的最低濃度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

抗真菌活性實(shí)驗(yàn)的菌種為白色念珠菌和黑曲霉，培養(yǎng)基為酵母霉菌專(zhuān)用培養(yǎng)基(Yeast and Mold Broth)，以兩性霉素B作為陽(yáng)性對(duì)照，同樣采用微量稀釋法進(jìn)行測(cè)定，28 ℃下培養(yǎng)72 h后，觀測(cè)真菌孢子液濁度的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 香樟精油不同提取方法的對(duì)比

分別計(jì)算了4種不同方法提取的精油得率，并測(cè)定了各精油樣品的性狀，結(jié)果如表1所示。CXE提取油呈淡綠色，具有較強(qiáng)的香樟精油特征性芳香氣味，相對(duì)密度為0.92 g/mL，折光系數(shù)為1.46，與傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾提取的精油性狀相近。CXE提取法的得率為1.35%，高于超臨界流體萃取法，由于CXE是一種由高比例、極性的乙醇和低比例、中低極性的超臨界或亞臨界二氧化碳組成的特殊流體，其極性范圍較純的超臨界流體更廣，具有更強(qiáng)的溶解能力；另一方面，由于氣體膨脹了液體，導(dǎo)致CXE流體的密度和黏度變小，溶劑的擴(kuò)散性能增強(qiáng)，更易從物料中萃取得到更多的精油。此外，乙醚提取法的得率雖高于CXE提取，但精油的芳香氣味較淡，且?guī)в忻黠@的乙醚氣味，可能存在溶劑殘留。因此，CXE屬于一類(lèi)安全、高效的萃取溶劑，且整個(gè)操作是在低溫、隔絕氧氣的條件下進(jìn)行，較傳統(tǒng)提取方法有一定的優(yōu)勢(shì)。

表1 不同方法所得香樟精油的比較

2.2 香樟精油的化學(xué)組成分析

通過(guò)GC-MS測(cè)定了4種不同方法提取的香樟精油化學(xué)組成，結(jié)果如表2所示。CXE提取油、SFE提取油、HD提取油和OSE提取油中分別鑒定出25種、16種、21種和22種化合物。在4種不同方法提取的香樟精油中，相對(duì)含量大于1%的共同成分有10種，分別為甲基庚烯酮、芳樟醇、1,8-桉葉油素、1-萜品烯醇、二氫香芹醇、β-萜品醇、萜烯醇、α-萜品醇、γ-萜品醇和α-長(zhǎng)葉蒎烯，分別占CXE油、SFE油、HD油和OSE油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的93.40%、96.20%、96.03%和95.41%。

表2 香樟精油的化學(xué)組成及質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%

表3 香樟精油成分分類(lèi)匯總分析

進(jìn)一步將表2中化合物進(jìn)行分類(lèi)匯總，共分為倍半萜烯類(lèi)碳?xì)浠衔铩o(wú)氧單萜類(lèi)化合物和含氧單萜類(lèi)化合物三類(lèi)，結(jié)果如表3所示。由表可知，CXE提取油中的含氧單萜類(lèi)化合物含量較低，但倍半萜烯類(lèi)化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.49%，顯著高于SFE提取油、HD提取油和OSE提取油，部分解釋了CXE法由于提取溫度低、隔絕氧氣等因素，精油中的組分不易被氧化或分解，利于保護(hù)精油中的有效成分。

2.3 抗氧化活性分析

分別測(cè)定了4種方法提取油對(duì)ABTS自由基和DPPH自由基的清除率，結(jié)果如圖1所示。CXE提取油對(duì)ABTS自由基的清除率高達(dá)85.88%，顯著高于SFE提取油和HD提取油，與OSE提取油差異不顯著。同時(shí)，CXE提取油對(duì)DPPH的清除率為82.42%，通過(guò)單因素方差分析，其清除能力均顯著高于其他3種方法提取油。萜品醇類(lèi)化合物如α-萜品醇等是精油中常見(jiàn)的抗氧化成分[18,19]，由表3可知，在CXE提取油中，萜品醇類(lèi)化合物的含量為50.98%，均高于HD提取油、SFE提取油和OSE提取油。此外，β-石竹烯是另一種常見(jiàn)的抗氧化成分[20]，在CXE提取油中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為0.05%，而在其他3種方法提取油中均未檢測(cè)到。由此可知，由于CXE整個(gè)操作環(huán)境為無(wú)氧、低溫狀態(tài)，精油中的抗氧化成分不易被破壞，因而其抗氧化活性顯著高于其他3種方法提取油。

圖1 香樟精油對(duì)ABTS自由基和DPPH自由基的清除能力

2.4 抑菌活性分析

植物精油的抑菌活性也是評(píng)價(jià)精油品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，表4為不同方法獲得的香樟精油抑菌活性結(jié)果。由表4可知，對(duì)2種革蘭氏陽(yáng)性菌而言，僅CXE提取油對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC值為312.5μg/mL，呈現(xiàn)中等活性抑菌等級(jí)，OSE提取油為弱活性抑菌等級(jí)(MIC=625 μg/mL)，而HD提取油和SFE提取油對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均無(wú)抑制作用；對(duì)2種革蘭氏陰性菌而言，CXE提取油對(duì)綠膿桿菌的MIC值為625 μg/mL，為弱活性抑菌等級(jí)，對(duì)大腸桿菌無(wú)抑制作用。需要指出的是，CXE提取油對(duì)兩種真菌具有極強(qiáng)的抑菌活性，其中對(duì)白色念珠菌的MIC值為39 μg/mL，對(duì)黑曲霉的MIC值為19.5 μg/mL，均顯著高于其他3種方法提取油。雖然精油抑菌機(jī)理復(fù)雜，構(gòu)效關(guān)系尚未明確，但有文獻(xiàn)表明芳樟醇、萜品醇等可能是香樟精油中的主要抗菌活性成分[21，22]，其中CXE提取油中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為31.22%和50.98%。此外，精油中高沸點(diǎn)部分的主要成分倍半萜烯類(lèi)化合物，CXE提取油中含有2.49%，除對(duì)芳香油的香味起著重要作用外，同樣具有抑菌活性[23]。

表4 不同方法獲得的香樟精油的抑菌活性分析

3 結(jié)論

本研究采用了一種新型的綠色溶劑CXE，從香樟葉中提取精油，通過(guò)調(diào)節(jié)二氧化碳和乙醇的比例，混合流體的極性范圍更廣，溶解能力更高，并且良好的擴(kuò)散性能使得CXE提取法的得率明顯高于傳統(tǒng)超臨界流體萃取法。由于CXE提取溫度低，隔絕氧氣，提高了香樟精油中抗氧化成分的含量，抗氧化活性均高于其他3種方法。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CXE提取油對(duì)白色念珠菌和黑曲霉呈現(xiàn)較高的抗菌活性。CXE提取可開(kāi)發(fā)成為一種提取高品質(zhì)植物精油的新方法，具有一定的應(yīng)用前景。