趙飛鵬，李木子，于曉麗，秦松躍，狄亞心，王一晗，姜艷平，崔 文，喬薪瑗

（東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

牛細小病毒（Bovine parvovirus，BPV）是細小病毒科（Parvoviridae）、細小病毒亞科（Parvovirinae）、牛犬細小病毒屬（Bocavirus）的成員。BPV 主要感染母牛生殖器官及犢牛的呼吸器官、消化器官，臨床表現(xiàn)為妊娠母牛的流產(chǎn)、死胎，犢牛主要表現(xiàn)為腸炎、腹瀉，給養(yǎng)牛業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失[1-3]。

目前，BPV 檢測方法主要有病原分離、電鏡、RT-PCR 和免疫熒光法等。病原分離操作難度大，培養(yǎng)技術及條件要求高，檢測周期長；電鏡技術對病毒濃度及儀器操作技術要求嚴格；RT-PCR 檢測靈敏性高，但特異性稍差。血清學反應是利用抗原與抗體在體外發(fā)生的特異性結合反應，通過已知抗體或抗原檢測未知抗原或抗體。血清學方法特異性強，且快速簡便。雙抗體夾心ELISA 是基于免疫酶技術的一種免疫測定方法，通過將已知抗體連接在固相載體上，待測抗原與之結合再與檢測抗體、酶標二抗結合。本研究利用BPV VP2 單克隆抗體（MAb）為檢測抗體，BPV VP2 多抗作為捕獲抗體，建立快速檢測BPV 的雙抗體夾心ELISA 方法，可為BPV 感染的疫情監(jiān)測和快速診斷提供技術手段。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料及實驗動物大腸桿菌感受態(tài)細胞Rosetta 購自北京全式金生物技術有限公司；pProHTa 表達載體購自NEB 公司；BT 細胞、BPV-1 Abnanti 株、牛輪狀病毒（BRV）NCDV 株、豬偽狂犬病毒（PRV）JL94 株、豬傳染性腸炎病毒（TGEV）LJB-03 株、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）NJ 株、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）BA 株均由本實驗室保存；91份健康牛糞便樣品取自黑龍江、遼寧、內蒙古3 個地區(qū)。6 周齡SPF 級BALB/c 鼠（體重為15 g～20 g）、體重2 kg～3 kg 的健康新西蘭兔均購自遼寧長生生物技術有限公司。

1.2 主要試劑病毒DNA 提取試劑盒、DNA 回收試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；弗氏完全佐劑（FCA）、弗氏不完全佐劑（FIA）、PEG 融合劑、50×HAT、HRP 標記的羊抗鼠IgG（IgG-HRP）、抗體亞類鑒定試劑盒、二甲亞楓（DMSO）均購自Sigma 公司；TMB 顯色液購自北京博奧拓達科技有限公司；Protein G 單克隆抗體純化樹脂柱購自GE 公司。

1.3 BPV VP2 基因的克隆及重組質粒的構建根據(jù)BPV Abinanti 株VP2 基因全序列（NC_001540.1）設計一對特異性引物，預期擴增片段長度為1 600 bp：P1：5'-CGACCTACAGGACTTTGTGGTGA-3'/P2：5'-GAAA GCTTATGGAGGTATCAAATGATATACCTAAC-3'，引物由吉林庫美公司合成。

提取BPV Abinanti 株核酸，利用設計的特異性引物（P1/P2）擴增BPV VP2 基因。PCR 產(chǎn)物經(jīng)DNA回收試劑盒回收純化，將其克隆至pMD19-T 載體，鑒定正確后，經(jīng)雙酶切，將目的片段亞克隆至pProHTa 表達載體，轉化大腸桿菌Rosetta 感受態(tài)細胞，構建重組菌pProHTa-BPV-VP2/Rosetta。

1.4 重組蛋白的表達及純化重組大腸桿菌pProHTa-BPV-VP2/Rosetta 接種于100 mL 氨芐抗性的LB 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600nm值約為1.0 時，加入0.002 mmol/L 的IPTG 誘導4 h。收集菌體，超聲破碎，4 ℃離心，取沉淀經(jīng)western blot 鑒定。鑒定正確的蛋白樣品經(jīng)單克隆抗體純化樹脂柱純化。

1.5 多克隆抗體的制備將純化的VP2蛋白與等劑量FCA乳化后，背部多點注射免疫新西蘭兔（2.5 kg）。兩周后，用純化的VP2 蛋白與等劑量FIA 乳化，進行第二次免疫。兩周后，進行第三次免疫，免疫劑量和方法同第二次免疫。第三次免疫后第7 d，經(jīng)耳緣靜脈采血，收集血清。通過間接ELISA 方法檢測血清抗體效價，當血清效價達到1∶12 800 以上時，心臟采血，并收集血清，-80 ℃保存。

1.6 MAb 的制備及鑒定將純化后的BPV VP2 蛋白免疫BALB/c 鼠（100 μg/只），間隔2 周，免疫3次，并于第3 次免疫后7 d 加強免疫。檢測小鼠血清抗體效價達到1∶10 000 以上時，取免疫鼠的脾臟，分離脾細胞，與SP2/0 細胞融合。以表達的BPV VP2重組蛋白為檢測抗原，采用間接ELISA 方法對融合的雜交瘤細胞進行篩選。采用有限稀釋法對陽性細胞株克隆3 次。通過間接免疫熒光（IFA）對MAb 特異性進行鑒定，以未接毒的BT 細胞作為陰性對照，將接種BPV 36 h 后的BT 細胞用PBS（pH 7.4）洗滌3 次，4%多聚甲醛固定，0.2% Trition-100 穿孔。洗滌3 次后，用0.3% BSA 封閉30 min。洗滌3 次，加入制備的MAb 作為一抗，37 ℃作用1 h，洗滌3次。加入FITC 標記的山羊抗小鼠IgG 作為熒光二抗，37 ℃作用30 min。洗滌3 次后，通過熒光顯微鏡觀察結果。并利用MAb 免疫球蛋白亞類鑒定試劑盒鑒定MAb 亞類，具體步驟參照試劑盒說明書。

1.7 雙抗體夾心ELISA 方法的建立

1.7.1 雙抗體夾心ELISA 方法最佳反應條件的確定從獲得的MAb 中選擇一株效價較高的MAb 用于后續(xù)實驗。以抗BPV MAb 為檢測抗體，制備的兔抗VP2多抗為捕獲抗體，建立雙抗體夾心ELISA 方法。利用方陣法分別對BPV VP2 重組蛋白（2.2 mg/mL）的包被濃度、MAb 稀釋度（1∶20～1∶640）、多抗稀釋度（1∶100～1∶3 200）、包被條件（37 ℃2 h、37 ℃1 h、37 ℃2 h+4 ℃12 h、37 ℃1 h+4 ℃12 h）、封閉液成分（2% BSA、5% BSA、2%脫脂乳和5%脫脂乳）、封閉時間（37 ℃60 min、37 ℃90 min、37 ℃120 min）和孵育時間（37 ℃60 min、37 ℃90 min、37 ℃120 min、37 ℃150 min）進行優(yōu)化，以確定最佳反應條件。

1.7.2 雙抗體夾心ELISA 方法臨界值的確定 采用建立的方法對91 份臨床健康牛糞便樣品（經(jīng)PCR 鑒定為陰性）進行檢測，測得OD450nm。計算樣本OD450nm的平均值（）和標準方差（SD），將OD490nm=+3SD定為樣本的陰、陽性的臨界值。當樣本的OD450nm≥-X+3SD 時，可以在99.9%的水平上判為陽性。反之，當樣本的OD450nm＜-X+3SD 時，則判為陰性。

1.7.3 特異性試驗 采用建立的雙抗體夾心ELISA方法分別對BPV、BRV、PRV、TGEV、PEDV 和BVDV 進行檢測，BT 細胞培養(yǎng)物作為陰性對照，分析該方法的特異性。

1.7.4 敏感性試驗 將BPV 細胞培養(yǎng)物（TCID50為10-3.06/0.1 mL）分別進行1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256 倍稀釋，分析雙抗體夾心ELISA 方法對BPV 的最低檢出量。

1.7.5 重復性試驗 選同一批次包被的酶標板檢測5 份BPV-1 Abnanti 株，每批樣品做4 個重復孔，同時選4 塊不同時間包被的酶標板，檢測5 份BPV-1 Abnanti 株，每份樣品做4 個重復孔，計算批內和批間檢測樣品OD450nm值的變異系數(shù)（CV），以檢驗批內和批間樣品的重復性。

1.7.6 臨床樣品的檢測 從黑龍江、遼寧和內蒙古3 個地區(qū)收集269 份犢牛腹瀉病料糞便樣品。將收集的樣品，用PBS（pH 7.4）緩沖液將其制成懸液，1500 r/min離心10 min 后取上清，分別利用建立的雙抗體夾心ELISA 和PCR 方法（P1/P2 引物）進行檢測，并比較二者檢測結果。

2 結 果

2.1 重組質粒的鑒定及重組蛋白的表達通過PCR擴增獲得BPV VP2 基因，將其克隆于pMD19-T 載體中，鑒定為陽性后，將目的片段亞克隆于pProHTa中。構建的重組質粒pProHTa-BPV-VP2經(jīng)雙酶切鑒定，結果顯示，酶切條帶大小約為6 000 bp和1 600 bp，與預期目的條帶大小相符（圖1A），且測序結果正確。將重組菌pProHTa-BPV-VP2/Rosetta 擴大培養(yǎng)后誘導表達，表達產(chǎn)物經(jīng)western blot鑒定，結果顯示，表達蛋白大小約為60 ku，與目的蛋白大小相符（圖1B），表明VP2 重組蛋白獲得表達。

2.2 MAb 的制備及鑒定結果經(jīng)3 次克隆后獲得5株MAb，分別命名為5G9、2B5、6A3、7E8 和2B6。經(jīng)抗體亞類鑒定，分別為IgG2a、IgG2b、IgM、IgM、IgA。

將5 株MAb 與感染BPV 的BT 細胞作用后，進行IFA 鑒定，結果顯示5 株MAb 上清均與BPV 反應，顯示特異性熒光，對照組未見特異性熒光（圖2）。表明5 株MAb 與BPV 均可發(fā)生特異性反應。

圖1 重組質粒的酶切鑒定（A）及VP2 重組蛋白表達的western blot 鑒定(B)結果Fig.1 Enzyme digestion of recombinant vector pProHTa-BPV-VP2(A)and identification of VP2 protein expression by western blot(B)

圖2 MAb 的IFA 鑒 定 結 果Fig.2 Identification of MAbs by indirect immunofluorescence assay

2.3 雙抗體夾心ELISA 方法的建立

2.3.1 最佳反應條件的確定 選擇效價較高的MAb 2B5 用于建立雙抗體夾心ELISA 方法。反應條件經(jīng)優(yōu)化后，確定BPV VP2 蛋白最佳包被濃度為0.9 μg/mL，最佳包被條件、封閉液成分、封閉時間和孵育時間見表1。

表1 最佳反應條件優(yōu)化結果Table 1 Optimization of working conditions

2.3.2 臨界值的確定 利用建立的雙抗體夾心ELISA 方法對91 份陰性樣品進行檢測，根據(jù)測得的OD450nm值經(jīng)計算，OD450nm平均值=0.091 833，標準差=0.003 430，+3SD=0.102 124，即當樣品OD450nm值≥0.102 124 時，判為陽性。

2.3.3 特異性試驗結果 采用建立的雙抗體夾心ELISA 方法分別檢測BPV、BRV、PRV、TGEV、PEDV 和BVDV，結果顯示該方法僅對BPV 檢測為陽性，而對其它病毒檢測為陰性（圖3）。表明所建立的方法具有較強的特異性。

圖3 特異性試驗結果Fig.3 Results of spectificity experiment

2.3.4 敏感性試驗結果 將BPV 細胞培養(yǎng)物2 倍倍比稀釋后，對建立方法的敏感性進行分析，結果顯示，當BPV 細胞培養(yǎng)物稀釋倍數(shù)為1∶32 時，檢測結果仍為陽性，即所建方法對BPV 的最低檢出量為3.125×102.8TCID50/mL（圖4）。表明所建立的方法具有較高的敏感性。

圖4 敏感性試驗結果Fig.4 Results of sensitivity experiment

2.3.5 重復性試驗結果 采用建立的雙抗體夾心ELISA 方法進行批內和批間重復性試驗，結果顯示，批內和批間重復性試驗的變異系數(shù)均小于10%（表2），表明建立的雙抗體夾心ELISA 法具有良好的重復性。

表2 重復性試驗結果Table 2 Results of intra-and inter-batches test

2.4 臨床樣品的檢測通過PCR 方法和本研究建立的雙抗體夾心ELISA 方法對269 份臨床腹瀉糞便樣品進行檢測，并將結果進行對比，雙抗體夾心ELISA 方法及PCR 方法均檢出完全相同的14 份陽性樣品，兩種方法檢測符合率為100%。表明所建立的雙抗體夾心ELISA 方法可以用于BPV 臨床血清學監(jiān)測。

3 討 論

BPV 感染的主要癥狀是急性腸胃炎，回腸和空腸黏膜出現(xiàn)不同程度充血、出血或潰瘍，嚴重者排出血便；懷孕母牛感染BPV 后表現(xiàn)為生殖機能障礙、流產(chǎn)，嚴重可引起死胎[4-6]。BPV 感染的初期癥狀不明顯，所以BPV 感染早期不易被發(fā)現(xiàn)。且牛細小病毒病是一種接觸性疾病，主要經(jīng)空氣傳播，導致該病防控比較困難，對畜牧業(yè)危害較大。因此，建立有效的快速檢測方法對該病的早期診斷及防控均具有重要意義。

BPV 有3 種結構蛋白（VP1、VP2、VP3），VP2 是病毒重要的衣殼蛋白，保守性高，且在病毒中含量高，適合用作檢測抗原[7]。研究表明，原核表達的VP2 蛋白具有與病毒天然蛋白相似的免疫活性，可用于制備BPV 檢測方法的診斷試劑[8]。因此，無論作為BPV 診斷抗原，還是用于抗體制備及疫苗研制方面，同其他蛋白相比，VP2 蛋白具有更大的優(yōu)勢。在本研究中，以VP2 作為免疫原，篩選了具有高親和力的MAb，可與天然BPV 發(fā)生特異性反應，可用作BPV 檢測的診斷試劑，為臨床診斷奠定基礎。

本研究利用免抗BPV VP2 多抗作為捕獲抗體，BPV VP2 MAb 作為檢測抗體，建立了雙抗體夾心ELISA 方法。反應中抗原與兩種抗體不同抗原決定簇結合，大大提高了檢測的特異性和敏感性，檢測結果可信度更高。該檢測方法中待檢樣品不需要進行病毒富集和特殊處理即可直接用于檢測。同時，陰性對照和陽性對照的設置保證了每次重復試驗的準確性。大量樣品檢測均處于同一反應體系中，操作步驟相同，可將操作過程中的誤差降到最低。此外，雙抗體夾心ELISA 方法的操作步驟簡單，耗費時間短，對于試驗人員的專業(yè)要求相對較低。且用于雙抗體夾心ELISA 方法的試劑非常普遍，價格便宜，使得雙抗體夾心ELISA 方法更具有普適性，可用于大批量樣品的檢測。與傳統(tǒng)方法相比，更具優(yōu)勢，更適合在臨床檢測中推廣[9-12]。

綜上，本研究建立的雙抗體夾心ELISA 方法特異性強、敏感性高、重復性好，可用于BPV 早期感染的診斷，為BPV 感染疾病的防控提供了一種快速檢測方法和監(jiān)測手段。