張小燕，周 倩，唐夢君，蒲俊華，張 靜，陳大偉，陸俊賢，高玉時

（江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇 揚州 225125）

彎曲菌（Campylobacter）尤其是空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni，C. jejuni）和結(jié)腸彎曲菌（Campylobacter coli，C.coli）是世界范圍內(nèi)最重要的人獸共患食源性病原菌[1]。人感染彎曲菌的臨床表現(xiàn)主要為腹瀉、發(fā)熱、頭痛或伴有嘔吐癥狀，空腸彎曲菌感染也可能導(dǎo)致一些自身免疫性疾病如格林巴利綜合征和米勒費歇綜合征[2]。多位點序列分型（Multilocus sequence typing，MLST）研究結(jié)果表明家禽是人感染彎曲菌的最重要來源[3-4]。雞腸道內(nèi)彎曲菌定殖量可高達(dá)8.6log cfu/g，并保持這種感染狀態(tài)直至屠宰[5-6]，容易造成屠宰、加工及零售環(huán)節(jié)禽肉及其產(chǎn)品的污染。

近年來，人醫(yī)臨床用藥和畜牧業(yè)抗菌藥物的大量使用甚至是濫用對包括彎曲菌在內(nèi)的病原菌產(chǎn)生了選擇性壓力，促進(jìn)耐藥彎曲菌的產(chǎn)生和流行[7]。

對于彎曲菌引發(fā)的腸胃疾病如腹瀉、便血等首選氟喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物治療，而當(dāng)發(fā)生全身性感染如菌血癥時，氨基糖苷類（尤其是慶大霉素）則是最佳治療藥物[8]。氨基糖苷類抗生素在畜禽養(yǎng)殖過程中的不規(guī)范使用造成了該類抗生素耐藥彎曲菌甚至多重耐藥彎曲菌的產(chǎn)生和傳播，致使我國彎曲菌多重耐藥情況嚴(yán)重[9]。為了解肉雞屠宰場彎曲菌耐藥性及氨基糖苷耐藥基因簇aadE-sat4-aphA-3 的分布特點，本研究對江蘇某肉雞屠宰場彎曲菌分離株進(jìn)行耐藥性分析，采用PCR檢測aadE-sat4-aphA-3 耐藥基因簇分布情況，并檢測部分該基因簇陽性菌株對氨基糖苷類藥物的MIC值，以期為彎曲菌氨基糖苷類藥物耐藥機制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌 株117 株彎曲菌分離自江蘇某一肉雞屠宰場加工生產(chǎn)鏈采集的3 批次樣品（泄殖腔棉拭、脫毛后胴體、開膛后胴體、消毒后胴體、成品雞及操作臺面和操作人員手套擦拭樣品），該3 批次樣品中的肉雞樣品來自江蘇省3 個不同的養(yǎng)殖場，時間分別為2017 年4 月（39 株）、8 月（38 株）和11 月（40株）。質(zhì)控菌為空腸彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC33560）購自中國微生物菌種保藏中心。

1.2 主要試劑彎曲菌CCDA 瓊脂培養(yǎng)基、MH 培養(yǎng)基、BHI 培養(yǎng)基等均購自O(shè)XOID 公司；脫纖維綿羊全血購自青島海博生物技術(shù)有限公司；9 大類26 種畜禽養(yǎng)殖常用抗菌藥物藥敏紙片均購自O(shè)XOID公司；卡那霉素、妥布霉素、阿米卡星、鏈霉素、慶大霉素等藥物均購自博邁德生物（Biomed）制品公司；微生物基因組提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；Buffer、dNTPs、TaqDNA 聚合酶、DNA Marker 均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 分離菌株的藥物敏感性試驗將117 株分離菌接種于含5%脫纖維羊血的MH 培養(yǎng)基，置42 ℃微需氧條件下培養(yǎng)36 h～48 h 后，制備0.5 麥?zhǔn)蠞舛染鷳乙骸⒄彰绹R床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）推薦方法對彎曲菌進(jìn)行9 大類26 種抗生素的藥敏試驗，本實驗結(jié)果為中度敏感的菌株均統(tǒng)計為敏感，耐藥菌株占比為0 則表示所有受試菌株均對該種藥物敏感。

1.4 分離菌株氨基糖苷類耐藥基因簇aadE-sat4-aphA-3的檢測以提取的分離菌基因組DNA 為模板，參照文獻(xiàn)[10]，采用PCR 檢測aadE-sat4-aphA-3耐藥基因簇，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產(chǎn)物，并經(jīng)測序鑒定，對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.5 部分菌株的MIC 值測定采用CLSI 推薦的瓊脂稀釋法[11]測定彎曲菌對5 種氨基糖苷類抗生素卡那霉素、慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素、鏈霉素的敏感性，以空腸彎曲菌ATCC33560作為質(zhì)控菌株。

2 結(jié)果與討論

2.1 藥敏試驗結(jié)果肉雞屠宰場3 批次分離的彎曲菌耐藥性結(jié)果顯示，共117 株彎曲菌對鏈霉素和卡那霉素的耐藥菌株占比均為93.2%（109/117），對妥布霉素的耐藥菌株占比為80.3%（94/117），對阿米卡星的耐藥菌株占比為36.8%（42/117），對慶大霉素的耐藥菌株占比為42.7%（50/117），對頭孢氨芐的耐藥菌株占比為96.6%（113/117），對氟喹諾酮類藥物耐藥菌株占比均大于89.7%（105/117），大環(huán)內(nèi)酯類藥物（59.8%）（70/117）、碳青霉烯類藥物（1.7%～17.1%）（2/117～20/117）、氯霉素類藥物（10.3%～17.9%）（12/117～21/117）耐藥菌株占比相對較低；第1 批次所有分離菌株均對大環(huán)內(nèi)酯類藥物（紅霉素、阿奇霉素）敏感，但第2、3 批次分離菌株對上述大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥的菌株占比均分別為81.6%（31/38）和100%（40/40）；受試的117 株分離菌中除第2 批次的7 株菌不具有多重耐藥性（耐3 類及以上藥物）外，其它110 株分離菌（94%）均表現(xiàn)出多重耐藥性。菌株的耐藥類型指該菌株耐藥的抗生素種類數(shù)與受測的抗生素總數(shù)的比值，如測定某一菌株對10 種抗生素的耐藥性，如果該菌對其中6 種抗生素均具有耐藥性，則該菌株的耐藥類型為0.6。本研究117 株分離的彎曲菌耐藥類型結(jié)果顯示，大部分菌株的耐藥類型集中于0.7～0.9（圖1）。以上結(jié)果表明江蘇某肉雞屠宰場分離的彎曲菌對畜禽養(yǎng)殖常用的抗菌藥物耐藥性較強且存在多重耐藥現(xiàn)象。同一批次菌株因其來源于同一養(yǎng)殖場因而具有相似的耐藥特性。研究表明彎曲菌感染與季節(jié)及溫度有很大的相關(guān)性[12]。彎曲菌雖然不能使雞發(fā)病，但肉雞在飼養(yǎng)過程中易感染大腸桿菌、球蟲病及呼吸道疾病等，養(yǎng)殖戶會根據(jù)肉雞飼養(yǎng)階段發(fā)病規(guī)律和外界環(huán)境變化等因素制定不同日齡肉雞的用藥程序，因此外界環(huán)境如溫度和季節(jié)不同，養(yǎng)殖場用藥可能會存在一定的差異。本研究3 批次樣品來源于3 個不同的養(yǎng)殖場，其耐藥性的差異可能與不同養(yǎng)殖場的用藥差異相關(guān)。

圖1 分離的彎曲菌耐藥類型的統(tǒng)計分析結(jié)果Fig.1 Analysis of resistant type of Campylobacter isolates

近年來監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示我國臨床分離的彎曲菌對氟喹諾酮耐藥的菌株占比在1994 年～2010 年間從50%上升至100%[13]。彎曲菌對多種抗生素耐藥情況比較嚴(yán)重，其中對環(huán)丙沙星和四環(huán)素耐藥的食品動物源彎曲菌株占比接近100%，對紅霉素耐藥的雞源結(jié)腸彎曲菌占比從2008 年～2009 年的48.7%上升至2012 年～2014 年的76.4%，對慶大霉素耐藥菌株占比從20%升高至80%，且多重耐藥情況嚴(yán)重[9,14]。多重耐藥彎曲菌具有通過食品源動物將細(xì)菌耐藥性傳遞給人類的風(fēng)險[15]。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明我國彎曲菌耐藥的嚴(yán)重性。因此建議畜禽養(yǎng)殖應(yīng)正確合理用藥，避免抗菌藥物的濫用尤其是預(yù)防性抗菌藥物的不合理使用；其次相關(guān)部門要進(jìn)一步加強對彎曲菌耐藥性的監(jiān)測，深入研究其對不同類藥物耐藥的機理，以便針對耐藥菌研發(fā)新型抗菌藥物。

2.2 分離菌aadE-sat4-aphA-3耐藥基因簇的檢測結(jié)果采用PCR 檢測分離的彎曲菌中氨基糖苷類耐藥基因簇aadE-sat4-aphA-3。結(jié)果顯示，共有90 株彎曲菌中擴增到長度約為1 500 bp 的目的片段，對部分菌株P(guān)CR 產(chǎn)物測序比對后確定其為氨基糖苷類耐藥基因簇aadE-sat4-aphA-3，部分菌株的PCR 擴增結(jié)果如圖2。該基因簇檢出率為76.9%，共有17株空腸彎曲菌，73 株結(jié)腸彎曲菌檢出該耐藥基因簇。結(jié)果表明該耐藥基因簇在肉雞屠宰場來源的彎曲菌中陽性率較高，可能與分離菌株對氨基糖苷類藥物的耐藥性有關(guān)。

氨基糖苷類耐藥基因簇aadE-sat4-aphA-3 于2004 年首次在空腸彎曲菌質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)，目前已陸續(xù)報道其在彎曲菌的質(zhì)粒和染色體中均出現(xiàn)，該耐藥基因簇的出現(xiàn)與彎曲菌受多種氨基糖苷類抗生素的選擇壓力有關(guān)[16]。而本研究中aadE-sat4-aphA-3 基因簇陽性率為76.9%，與以往研究結(jié)果[10,17-18]相比均較高，這可能與屠宰場3 個批次分離菌株均來自于江蘇省有關(guān)。

圖2 部分分離菌株aadE-sat4-aphA-3 基因簇的PCR 檢測結(jié)果Fig.2 The detection results of aadE-sat4-aphA-3 in partial isolates by PCR

2.3aadE-sat4-aphA-3陽性彎曲菌MIC 值的測定結(jié)果選取20 株aadE-sat4-aphA-3 陽性彎曲菌進(jìn)行氨基糖苷類5 種抗菌藥物敏感性試驗。參照文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)[11]，菌株對慶大霉素、鏈霉素和妥布霉素的MIC值≥8 μg/mL 為耐藥，對卡那霉素和阿米卡星MIC 值≥64 μg/mL 為耐藥。結(jié)果顯示，第1、3 批次所有菌株均對卡那霉素、妥布霉素、鏈霉素耐藥，其中13株該基因簇陽性菌對妥布霉素耐藥性較強（MIC 值為512 μg/mL）；第2 批次有2 株菌均對卡那霉素、妥布霉素、鏈霉素耐藥（MIC 值≥128 μg/mL），其余菌株對除卡那霉素外的其余4 種藥物均敏感。20 株aadE-sat4-aphA-3 基因簇陽性彎曲菌中共有12 株對慶大霉素耐藥，MIC 值最高為256 μg/mL；共有11株菌對受試的5 種氨基糖苷類藥物均耐藥，且大部分菌株對阿米卡星、妥布霉素的MIC 值≥256 μg/mL（表1）。上述結(jié)果表明，aadE-sat4-aphA-3 基因簇陽性彎曲菌對氨基糖苷類藥物有較強的耐藥性。

表1 20 株aadE-sat4-aphA-3 陽性彎曲菌對氨基糖苷類藥物的MIC 值Table 1 MIC value of 20 aadE-sat4-aphA-3 positive strains to aminoglycosides

大環(huán)內(nèi)酯類藥物是臨床上治療彎曲菌病的首選藥物，但對于彎曲菌引起的重度感染、急性和全身性感染，則需用氨基糖苷類藥物（慶大霉素、阿米卡星和鏈霉素）治療[19-20]。國內(nèi)養(yǎng)殖場常利用某些氨基糖苷類藥物如阿米卡星和慶大霉素預(yù)防和治療畜禽細(xì)菌性疾病，將安普霉素（氨基糖苷類藥物）添加于飼料或飲水中用于促進(jìn)畜禽的生長，這在一定程度上造成氨基糖苷類藥物耐藥彎曲菌的產(chǎn)生和傳播。本研究隨機選擇的20 株氨基糖苷類耐藥基因簇陽性彎曲菌中有11 株對受試的5 種氨基糖苷類藥物均耐藥，且大部分分離菌對阿米卡星、妥布霉素的MIC 值≥256 μg/mL。提示攜帶aadE-sat4-aphA-3 基因簇的彎曲菌有可能給公共衛(wèi)生和人類健康帶來一定風(fēng)險，進(jìn)一步開展對aadE-sat4-aphA-3 耐藥基因簇陽性彎曲菌的監(jiān)測和傳播特點研究很有必要。