戴佳文，吳健，尤小蘭，王元杰，趙小軍，程之逸，劉貴遠(yuǎn)，黃傳江

（1.泰州市第三人民醫(yī)院，江蘇泰州225321；2.泰州市人民醫(yī)院，江蘇泰州225300）

世界范圍內(nèi)，胃癌是第5大惡性腫瘤，是癌癥相關(guān)死亡的第3大原因[1]。全球每年新增胃癌100余萬(wàn)例，其中40%發(fā)生在中國(guó)，且胃癌死亡事件也主要發(fā)生在中國(guó)[2]，嚴(yán)重威脅國(guó)人健康。以手術(shù)為主的綜合治療并沒(méi)有有效地改善進(jìn)展期胃癌患者的預(yù)后，進(jìn)展期胃癌的患者5年整體生存率不到30%[3]。近年來(lái)，靶向VEGF受體抑制內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管生成的單克隆抗體已成為晚期胃癌患者挽救治療的重要途徑[4]。然而，靶向VEGF信號(hào)的藥物并未取得預(yù)期療效。胃癌組織中血管擬態(tài)（Vascular Mimicry,VM）樣結(jié)構(gòu)的存在可能是抗內(nèi)皮細(xì)胞依賴血管生成藥物治療失敗的重要機(jī)制[5]。探索胃癌組織中VM樣結(jié)構(gòu)生成狀況及其對(duì)胃癌患者預(yù)后的影響，探尋胃癌治療的新靶點(diǎn)，對(duì)提高胃癌患者整體臨床療效具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料我們建立了泰州地區(qū)胃腸腫瘤生物樣本庫(kù)，從樣本庫(kù)中調(diào)取了2012年6月至2013年12月在江蘇省泰州市人民醫(yī)院胃腸外科進(jìn)行胃癌根治手術(shù)患者的石蠟標(biāo)本，按照病例納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，最終入組130例。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）行D2胃癌根治達(dá)R0切除；（2）術(shù)前檢查無(wú)手術(shù)禁忌癥；（3）術(shù)后病理資料完整；（4）術(shù)后完成半年輔助化療；（5）臨床隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前接受過(guò)新輔助放化療；（2）姑息性手術(shù)；（3）伴有其他系統(tǒng)惡性患者；（4）合并嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病患者?；颊呋€資料詳見表1，本組病例無(wú)圍手術(shù)期死亡及嚴(yán)重并發(fā)癥發(fā)生。根據(jù)術(shù)后病理結(jié)果，有化療指征的患者術(shù)后4周開始進(jìn)行XELOX或FOLFOX方案化療，總療程6個(gè)月。自患者手術(shù)后出院即開始隨訪，至2019年12月本課題結(jié)束，臨床隨訪5年，共有73例（56.15%）發(fā)生轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，其中69例（53.08%）患者死亡，死亡最早在手術(shù)后5個(gè)月。

1.1.2 主要儀器與試劑LEICA全自動(dòng)組織脫水機(jī)（ASP300，德國(guó)萊卡）；派斯杰多功能包埋機(jī)（BM450A中國(guó)常州）；LEICA切片機(jī)（RM2235，德國(guó)萊卡）；奧林巴斯顯微鏡（MPUS BX51，日本）；小鼠抗CD34單克隆抗體（一抗）（abcam公司,ab8536）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗鼠/兔免疫球蛋白多聚體分子（二抗）（Dako公司）；3，3－二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽（DAB顯色劑，Dako公司）；透明液（北京九州柏林生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 CD34-PAS免疫組化雙重染色應(yīng)用福爾馬林固定、石蠟包埋的組織進(jìn)行免疫組化染色均。將蠟塊包埋的組織制成4μm厚度的切片。將切片在二甲苯中脫蠟，并在梯度乙醇中水化；3%的過(guò)氧化氫的甲醇溶液封閉10分鐘處理內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；磷酸鹽緩沖液洗滌切片3遍后在微波爐中在95°C下用檸檬酸鹽緩沖液預(yù)處理20分鐘進(jìn)行抗原熱修復(fù)；在載玻片上滴加CD34一抗（1:200）4°C孵育過(guò)夜；磷酸鹽緩沖液沖洗3分鐘，甩干玻片后滴加二抗，濕盒內(nèi)孵育30分鐘；磷酸鹽緩沖液再次沖洗3分鐘，甩干玻片后滴加DAB液（1:50）進(jìn)行顯色，室溫孵育10min；DAB反應(yīng)后，將切片用0.5%高碘酸溶液處理10分鐘，并用蒸餾水沖洗3次，持續(xù)3分鐘；Schiff溶液避光染色20分鐘；顯色后的切片充分水洗后放入蘇木素中染5分鐘后再次水洗，流水沖洗10分鐘；梯度酒精丙酮浸泡后蓋玻片蓋好。

1.2.2 CD34-PAS雙重染色的評(píng)估每個(gè)標(biāo)本均進(jìn)行CD34–PAS免疫組化染色3次，CD34陰性對(duì)照（省略一抗）其他操作步驟不變，陽(yáng)性對(duì)照由CD34試劑供應(yīng)商提供，所有切片由兩位主治醫(yī)師以上資深病理科醫(yī)生采用MPUS BX51顯微鏡讀片，獨(dú)立診斷完成。在CD34–PAS雙重染色中，VM陽(yáng)性狀態(tài)表現(xiàn)為粘多糖圍成的通道樣結(jié)構(gòu)，PAS染色陽(yáng)性，但CD34陰性，管道內(nèi)可見紅細(xì)胞。VM陰性狀態(tài)即組織中僅可見CD34陽(yáng)性表達(dá)的內(nèi)皮細(xì)胞依賴血管。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)方法所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料用`x±s表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行均數(shù)比較；采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，兩組患者生存率采用Log-rank法進(jìn)行比較；采用Cox回歸模型法分析影響胃癌患者總生存期的危險(xiǎn)因素。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VM僅見于胃癌組織，胃粘膜組織中未見VM CD34-PAS免疫組化雙染顯示僅胃癌組織中存在VM樣結(jié)構(gòu)，同一張胃癌組織切片中可見內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管和VM，VM樣結(jié)構(gòu)中及內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管中均可見紅細(xì)胞。相應(yīng)的胃粘膜組織中僅見內(nèi)皮細(xì)胞依賴血管，未見VM樣結(jié)構(gòu)。

2.2 胃癌組織中血管擬態(tài)生成與各臨床病理特征之間關(guān)系CD34-PAS雙重染色顯示130例胃癌患者中31例患者胃癌組織中VM陽(yáng)性表達(dá)（23.85%）；其余99例為VM陰性（76.15%）。根據(jù)CD34-PAS免疫組化雙染結(jié)果，將患者分為VM陽(yáng)性組（31例），VM陰性組（99例），分析VM生成與胃癌患臨床病理特征之間的關(guān)系，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明胃癌組織中VM生成與腫瘤大小、腫瘤分化程度，腫瘤侵襲深度、胃周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、TNM分期及脈管中有無(wú)癌栓均相關(guān)（P均＜0.05，見表1）。

表1胃癌組織中VM生成與病理特征之間關(guān)系

續(xù)表

2.3 胃癌組織VM生成對(duì)患者預(yù)后的影響

2.3.1 胃癌組織中VM生成對(duì)患者OS影響VM陰性組患者總生存時(shí)間48.28±1.64月（95%CI：45.06～51.50），VM陽(yáng)性組患者總生存時(shí)間24.88±2.11月（95%CI：20.75～29.01），兩組OS差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LogRank:Chi-squre=58.35,P<0.01，見圖1）。

2.3.2 胃癌組織中VM生成對(duì)患者DFS的影響VM陰性組患者無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間44.88±1.88月（95%CI：41.19～48.57），VM陽(yáng)性組患者無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間19.26±1.78月（95%CI：15.76～22.75），兩組DFS差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log Rank:Chisqure=59.45，P<0.01，見圖2）。

圖1胃癌組織中VM生成對(duì)OS的影響

圖2胃癌組織中VM生成對(duì)DFS的影響

2.4 影響胃癌患者預(yù)后的單因素分析根據(jù)患者術(shù)后生存狀態(tài)，分為生存組及死亡組，比較各臨床病理參數(shù)及胃癌組織中VM生成與患者生存之間的關(guān)系。單因素生存分析顯示，年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、腫瘤分化、浸潤(rùn)深度、胃周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、TNM分期、脈管內(nèi)有無(wú)癌栓及VM生成狀態(tài)是影響本組患者預(yù)后的單因素（見表2）。

表2影響本組130例患者術(shù)后總體生存率的單因素分析

2.5 影響胃癌患者預(yù)后的多因素回歸分析多因素回歸分析結(jié)果顯示，腫瘤分期、VM生成、腫瘤分化、脈管內(nèi)有無(wú)癌栓是影響本組患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)后因素（見表3）。

表3影響本組130例患者術(shù)后總體生存率的多因素回歸分析

3 討論

VM是指某些高度惡性腫瘤細(xì)胞通過(guò)自身變形模擬血管內(nèi)皮細(xì)胞并與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用模仿血管壁結(jié)構(gòu)形成可以運(yùn)輸血液（血漿、紅細(xì)胞）的管道系統(tǒng)，從而重塑腫瘤微循環(huán)，并與宿主血管相連使腫瘤獲得血液供應(yīng)的一種現(xiàn)象[6]。VM具有如下特點(diǎn)：形成的血管管道呈簇狀或圖案樣排列；管道內(nèi)沒(méi)有血管內(nèi)皮細(xì)胞襯墊覆蓋，免疫組化CD31/CD34染色陰性；被大量的層粘連蛋白、纖維粘連蛋白以及膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)包繞，過(guò)碘酸-雪夫（Periodic Acid-Schiff，PAS）染色陽(yáng)性[7]。VM是腫瘤經(jīng)典血液供應(yīng)的重要補(bǔ)充，可以為腫瘤組織提供更多的血液供應(yīng)，對(duì)內(nèi)皮依賴性血管是腫瘤唯一血液供應(yīng)方式的傳統(tǒng)觀念提出了挑戰(zhàn)。同時(shí)，VM的存在解釋了抗血管生成靶向藥物療效不如預(yù)期的原因[5]。

1999年，Maniotis等[7]在黑素瘤中發(fā)現(xiàn)并定義了VM，繼而更多學(xué)者在多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了此類內(nèi)有紅細(xì)胞但沒(méi)有內(nèi)皮細(xì)胞的管道樣結(jié)構(gòu)。VM為快速生長(zhǎng)的腫瘤提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，并且基于VM缺乏內(nèi)皮結(jié)構(gòu)，通過(guò)滲漏作用增加腫瘤灌注。此外，已有研究發(fā)現(xiàn)VM與內(nèi)皮細(xì)胞依賴血管相通[8]，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移。VM樣結(jié)構(gòu)因缺乏內(nèi)皮細(xì)胞，所以靶向內(nèi)皮細(xì)胞的抗血管生成藥物對(duì)其作用甚微。甚至有研究[8]發(fā)現(xiàn)，抗血管生成治療使血管密度下降，導(dǎo)致組織乏氧，而乏氧環(huán)境促進(jìn)了VM的形成，加速腫瘤進(jìn)程。目前有關(guān)胃癌VM生成，以及VM在胃癌預(yù)后評(píng)估中的預(yù)測(cè)價(jià)值的報(bào)道甚少，通過(guò)檢查胃癌組織中VM生成，探尋血管擬態(tài)與各臨床病理參數(shù)及患者術(shù)后生存之間的關(guān)系，分析VM在胃癌預(yù)后評(píng)估中的預(yù)測(cè)價(jià)值，將為胃癌預(yù)后評(píng)估提供一個(gè)全新的方法。

本研究通過(guò)CD34-PAS免疫組化雙染發(fā)現(xiàn)VM僅在胃癌組織中表達(dá)，胃粘膜組織中檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)VM，進(jìn)一步佐證了VM生成與腫瘤惡性生物學(xué)行為之間的關(guān)系。本研究中，我們檢查了130例胃癌患者胃癌組織標(biāo)本，其中31例（23.85%）VM陽(yáng)性，且VM的發(fā)生率隨著胃癌進(jìn)展而增加。胃癌VM生成與與腫瘤大小、腫瘤分化程度，腫瘤侵襲深度，TNM分期，胃周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管中有無(wú)癌栓均相關(guān)，表明胃癌組織中VM生成預(yù)示患者不良預(yù)后。然而，胃癌組織中VM生成對(duì)胃癌患者術(shù)后總體生存率的影響仍存在爭(zhēng)議，既往一項(xiàng)研究報(bào)道，胃癌組織中VM生成與胃癌患者的預(yù)后沒(méi)有密切關(guān)系[9]。本研究通過(guò)對(duì)患者術(shù)后5年的隨訪分析發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中VM陰性患者的5年總體生存率及無(wú)病生存率均顯著高于VM陽(yáng)性組患者。在進(jìn)一步的研究中，我們分析了影響本組130例患者術(shù)后總體生存的單因素。單因素生存分析顯示，患者年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、腫瘤分化、浸潤(rùn)深度、胃周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、TNM分期、脈管內(nèi)有無(wú)癌栓及VM生成是影響本組患者預(yù)后的因素。眾所周知，腫瘤大小、腫瘤分化、浸潤(rùn)深度、胃周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、TNM分期、脈管內(nèi)有無(wú)癌栓等為胃癌預(yù)后不良因素，而腫瘤的位置及患者年齡與預(yù)后的影響未見類似報(bào)道。然而，多因素回歸分析結(jié)果表明胃癌患者TNM分期、腫瘤分化、脈管內(nèi)有無(wú)癌栓及VM生成狀況是影響本組患者術(shù)后總體生存率的獨(dú)立預(yù)后因素。胃癌VM生成預(yù)示著腫瘤細(xì)胞的高侵襲性，與腫瘤的復(fù)發(fā)進(jìn)展密切相關(guān)，這與既往研究結(jié)果一致[10]。

總之，胃癌組織中VM生成是胃癌患者預(yù)后不良的一項(xiàng)重要指標(biāo)。臨床檢測(cè)胃癌組織中VM生成狀況，有利于患者預(yù)后評(píng)估，指導(dǎo)患者臨床治療。此外，進(jìn)一步探尋胃癌組織中VM生成機(jī)制，為胃癌術(shù)后綜合治療提供全新的靶點(diǎn)，有望提高胃癌患者術(shù)后整體療效，提高進(jìn)展期胃癌患者總體生存率。