楊亞靜，張相春

（遵義師范學(xué)院 生物與農(nóng)業(yè)科技學(xué)院（食品科技學(xué)院），貴州 遵義 563006）

谷類雜糧制品主要是指以玉米、黑米、小米、薏米、高粱、燕麥、大麥、紅米、紅稗等雜糧蒸煮或者粉碎制得的食品，營養(yǎng)豐富，富含多種維生素、礦物質(zhì)和膳食纖維。但是，同樣這些雜糧在生長過程中也會受到易病蟲害危害產(chǎn)生真菌毒素，從而影響產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量、埋下食品安全隱患[1]。目前對糧谷的真菌毒素報道很多[2-6]，對谷類雜糧制品的研究較少，特別是在3種嘔吐毒素類-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-acetyldeoxynivalenol，3-ADON）、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15-acetyldeoxyn-ivalenol，15-ADON）以及玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZON）等真菌毒素方面鮮有報道。CASTILLO M D等[7]研究發(fā)現(xiàn)，黑豆可能存在鏈格孢霉毒素、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）和單端孢霉烯族毒素的污染風(fēng)險；TSENG T C等[8]在赤豆和綠豆中檢測到了伏馬菌素B1（fumonisin B1，F(xiàn)B1）。

目前，真菌毒素檢測的方法主要有薄層色譜法、酶聯(lián)吸附免疫法、高效液相色譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（high performance liquid chromatography mass spectrometry，HPLC-MS/MS）[9-12]。薄層色譜法對檢測儀器及人員要求較低，但是此方法精度較差、實驗步驟冗長繁多、重現(xiàn)性不好[13]；酶聯(lián)免疫吸附試驗法具有靈敏、快速等優(yōu)點，但是存在交叉污染反應(yīng)的缺點[14]；高效液相色譜法應(yīng)用較為廣泛，檢測穩(wěn)定性較好，但樣品中基質(zhì)易對目標(biāo)物產(chǎn)生干擾，前處理過程繁瑣，對操作人員要求高，且采用的免疫親和柱成本較昂貴[15]。鑒于上述方法存在的前處理中有些步驟和條件的缺陷，或者易定性誤判等不足，本研究嘗試運(yùn)用QuEChERS前處理凈化技術(shù)，簡化提取過程，建立快速、容易、便宜、有效、穩(wěn)定和可靠（Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe，QuEChERS）的凈化技術(shù)結(jié)合高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測谷類雜糧制品中DON、3-ADON、15-ADON 和ZON同時檢測的方法，該研究對評價此類食品的安全具有重要意義，也為谷類雜糧制品中真菌毒素的分析和監(jiān)控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DON溶液標(biāo)準(zhǔn)品（100 μg/mL）、3-ADON溶液標(biāo)準(zhǔn)品（100 μg/mL）、15-ADON溶液標(biāo)準(zhǔn)品（100 μg/mL）、ZON溶液標(biāo)準(zhǔn)品（100 μg/mL）：中國計量科學(xué)研究院；甲醇、乙腈（色譜純）：德國Merck公司；甲酸（色譜純）：上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2695型高效液相色譜儀：美國Waters公司；API 3500 QTrap超高壓液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國AB公司；Milli-Q純水儀：美國Millipore公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Zorba-C18柱（2.1 mm×150 mm，3 μm）；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30 ℃；流動相：A為0.10%甲酸溶液，B為乙腈；洗脫條件見表1。

表1 HPLC-MS/MS梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of HPLC-MS/MS

1.3.2 樣品的提取與凈化

稱取1.0 g混合鹽析劑置于10 mL離心管中，加入2.0 g樣品，加入4.0 mL提取溶液。取1 mL上清液于2.0 mL PE管中，加入吸附劑后渦旋10 s，離心取上清液，過膜后上機(jī)進(jìn)樣分析。實驗分別比較不同的提取溶液以及吸附劑組合，對4種真菌毒素檢測的影響。其中提取液分別比較了提取溶液Ⅰ（甲醇∶水=20∶80，V/V）、提取溶液Ⅱ（甲醇∶水=10∶90，V/V）、提取溶液Ⅲ（乙腈∶水=20∶80，V/V）、提取溶液Ⅳ（乙腈∶水=10∶90，V/V）共4種，對目標(biāo)物提取的影響；吸附劑比較了C18、Florial、SAX、GCB、Al2O3、PSA共6種以及未使用吸附劑時對目標(biāo)物提取的影響，并在上述優(yōu)化基礎(chǔ)上比較C18+無水硫酸鎂粉末（100 mg+300 mg）、Florisil+無水硫酸鎂粉末（100 mg+300 mg）和Florisil+C18+無水硫酸鎂粉末（50 mg+50 mg+300 mg）共3種配比，來優(yōu)化QuEChERS吸附劑組合。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

DON、3-ADON、ZON用乙腈配制成1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，15-ADON用乙腈配制成10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于4 ℃冰箱中儲存。

1.3.4 方法的精密度、重復(fù)性與回收率

以未檢出4種真菌毒素的谷類雜糧樣品為空白基質(zhì)，加入不同濃度的DON、3-ADON、15-ADON、ZON混合標(biāo)液，使用QuEChERS提取后，上機(jī)檢測計算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 QuEChERS前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 提取溶液的選擇

嘔吐毒素類（DON、3-ADON、15-ADON）的提取溶液一般采用純水，而玉米赤霉烯酮（ZON）的提取一般采用甲醇-水或者乙腈-水體系，且在實驗中發(fā)現(xiàn)，提取溶液與試樣比為2∶1（mL∶g）時，加入鹽析劑樣品高速均質(zhì)后不易產(chǎn)生乳濁液，上層提取液易過濾分層[16-18]。因此，采用4種提取溶液分別提取加標(biāo)樣品中的4種真菌毒素，實驗結(jié)果以樣品中4種真菌毒素的加標(biāo)回收率來比較提取溶液效果，結(jié)果見圖1。

圖1 提取溶液對4種真菌毒素回收率的影響Fig.1 Effect of extraction solution on recovery rates of four mycotoxins

由圖1可知，含20%有機(jī)相的提取液對嘔吐毒素類提取效果不佳，含10%的有機(jī)相提取液效果較好，其中提取溶液Ⅳ（乙腈∶水=10∶90，V/V）的提取效果最優(yōu)，4種真菌毒素的加標(biāo)回收率都能達(dá)到90%以上，在此比例的提取溶液條件下，既能保證嘔吐毒素類毒素的活性，又能提高4種目標(biāo)物在提取液中的分配系數(shù)。

2.1.2 吸附劑的優(yōu)化

本試驗對比了混合標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)過6種不同吸附劑和未使用吸附劑時各真菌毒素的回收率[19-20]，結(jié)果見圖2。

圖2 4種真菌毒素經(jīng)不同吸附劑處理后的回收率Fig.2 Recovery of four mycotoxins treated with different adsorbent

由圖2可知，C18和Florisil對4種真菌毒素的回收率均較好，均在70%以上，而其他4種吸附劑凈化后的真菌毒素回收率較低，因此，本試驗選擇C18和Florisil填料作為QuEChERS凈化的吸附劑。

一般QuEChERS凈化處理中會添加無水硫酸鎂粉末，起到除水的作用，以提高目標(biāo)物的響應(yīng)值，所以試驗比較了3種QuEChERS吸附劑組合對回收率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 4種真菌毒素經(jīng)不同吸附劑組合處理后的回收率Fig.3 Recovery of four mycotoxins treated with different adsorbent combination

由圖3可知，F(xiàn)lorisil+C18+無水硫酸鎂粉末（50 mg+50 mg+300 mg）組合對4種真毒毒素的回收率較高，主要因為Florisil能吸附強(qiáng)極性組分與C18能吸附弱極性組分，兩者形成互補(bǔ)，并添加了無水硫酸鎂，起到除水的作用，所以本試驗選擇該組合作為吸附劑組成。

2.2 流動相的選擇

嘔吐毒素類以及玉米赤霉烯酮屬于極性化合物，因此選擇水和乙腈作為流動相的基礎(chǔ)溶劑，為了促進(jìn)樣品的離子化，本實驗比較了水相分別為0.1%甲酸、0.1%乙酸和10 mmol/L乙酸銨對4種真菌毒素分離效果的影響。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入0.1%甲酸時，4種目標(biāo)物的離子豐度最強(qiáng)，分離度較好，因此選擇濃度為0.1%甲酸為水相，與乙腈組合組成流動相進(jìn)行梯度洗脫，得到ZON、DON、與3-ADON和15-ADON在色譜分析圖上有很好的分離度，4種目標(biāo)物的離子豐度都較強(qiáng)，無雜質(zhì)干擾，色譜圖見圖4。

圖4 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.4 Chromatogram of mixture standard solution

由圖4可知，4種目標(biāo)化合物得以很好的分離。

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

用質(zhì)量濃度為50 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，對目標(biāo)物進(jìn)行一級和二級質(zhì)譜掃描，并優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。依據(jù)目標(biāo)物的分子式和碎片離子信息擬合出理論精確質(zhì)量數(shù)，采用多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式進(jìn)行優(yōu)化參數(shù)，4種化合物優(yōu)化后的質(zhì)譜分析參數(shù)見表2。

表2 4種真菌毒素的多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometric parameters for monitoring the scanning patterns of four mycotoxins with multiple reactions

2.4 方法的線性范圍、檢出限與定量限

在0.10%甲酸-乙腈流動相體系中，按照1.3.2方法進(jìn)行前處理，得到空白基質(zhì)提取液，用空白基質(zhì)提取液稀釋，配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以表1梯度洗脫的步驟，經(jīng)儀器進(jìn)行分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表3。

表3 4種真菌毒素的保留時間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 3 Retention time,standard curve,correlation coefficient,detection limit and quantitative limit of four mycotoxins

由表3可知，4種真菌毒素在上述各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999。4種真菌毒素的檢出限分別為DON 0.3 μg/kg、3-ADON 0.4 μg/kg、15-ADON 2.0 μg/kg、ZON 0.2 μg/kg，定量限分別為DON 1.0 μg/kg、3-ADON 1.5 μg/kg、15-ADON 6.0 μg/kg、ZON 0.8 μg/kg。

2.5 方法的回收率與精密度

在加標(biāo)回收實驗中，選用雜糧粥、雜糧飯、雜糧代餐粉3種空白基質(zhì)的樣品，分別添加1倍限量、5倍限量和10倍限量低、中、高的三個水平的標(biāo)準(zhǔn)品，每個結(jié)果測定5次，進(jìn)行加標(biāo)回收的試驗，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表4。

表4 方法的回收率試驗結(jié)果Table 4 Results of recovery rate of the method

由表4可見，4種真菌毒素DON、3-ADON、15-ADON、ZON在不同基質(zhì)中的回收率范圍為85.1%～102.0%，RSD為2.11%～6.22%，說明本實驗的檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度和精密度可行。

2.6 實際樣品的檢測

應(yīng)用本方法對10份谷類雜糧制品進(jìn)行檢測，以保留時間和碎片離子定性，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，其中2份樣品均有檢出不同濃度的DON，含量分別110.3 μg/kg和260.5 μg/kg，均未超過國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的限量要求，除此以外的3種真菌毒素均未檢出。

3 結(jié)論

本研究建立了一種QuEChERS-HPLC-MS/MS檢測谷類雜糧制品中DON、3-ADON、15-ADON、ZON 4種真菌毒素的分析方法。實驗結(jié)果表明，樣品經(jīng)乙腈/水（10∶90，V/V）進(jìn)行提取后，經(jīng)Florisil+C18+無水硫酸鎂組合吸附劑處理后，可有效去除谷類雜糧制品中的干擾物對目標(biāo)峰的影響，實現(xiàn)對4種真菌毒素的凈化，在質(zhì)譜檢測器的多反應(yīng)監(jiān)測模式下，可實現(xiàn)同時對谷類雜糧制品中4種真毒毒素的定性和定量分析。在3種谷類雜糧樣品基質(zhì)中的加標(biāo)回收率為85.1%～102.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在2.11%～6.22%之間，所建立的方法具有可靠的準(zhǔn)確度和精密度，能準(zhǔn)確快速有效地檢測谷類雜糧樣品基質(zhì)中的4種真菌毒素的含量。