孫美玲，吳杰雄，李新瑞，商飛飛

（1.湖北大學知行學院 糧食與食品工程學院，湖北 武漢 430011；2.賀州學院 食品與生物工程學院，廣西 賀州 542899）

以獼猴桃果實為原料，通過酵母菌發(fā)酵釀制而成的果酒兼具營養(yǎng)和保健雙重功能，既含有獼猴桃維生素C、維生素B族、碳水化合物、蛋白質、脂肪、鈣、鐵、磷、硒等營養(yǎng)物質；又有發(fā)酵型果酒促進血液循環(huán)和機體的新陳代謝，控制體內膽固醇水平，改善心腦血管等保健功效[2-3]。王東偉等[4]以黃心獼猴桃為原料發(fā)酵果酒，在發(fā)酵溫度22.07 ℃，初始糖度為22.58°Bx，酵母接種量0.13%條件下，酒精度可達8.94%vol；在果酒陳釀期間，隨著陳釀時間的延長，黃心獼猴桃果酒的抗氧化能力和酚類物質含量均有所降低。相同陳釀時間下，4 ℃陳釀的黃心獼猴桃果酒的體外抗氧化能力高于18 ℃陳釀的獼猴桃果酒。孫洪浩等[5]研究了野生獼猴桃發(fā)酵最佳工藝參數(shù)：果膠酶用量80 mg/L，SO2添加量為72 mg/L，發(fā)酵基質初始pH 3.5，活性干酵母接種量300 mg/L，發(fā)酵溫度25 ℃，該工藝釀造的野生獼猴桃干酒口感豐滿、香氣協(xié)調、維生素C含量高。

釀酒酵母ZGJ-1（專利號：ZL201210561882.X）是項目組人員從自然界野生資源中分離純化并已改良的高產(chǎn)酒發(fā)酵專用菌株，該菌株具備發(fā)酵性能強、產(chǎn)香好、產(chǎn)酒品質穩(wěn)定等特點，并通過了中國典型專利培養(yǎng)物保藏中心鑒定（保藏號為CCTCC NO：2012472）。本研究以項目組分離純化的純天然果酒專用菌種ZGJ-1為發(fā)酵菌株，采用游離與固定化兩種方式發(fā)酵獼猴桃汁，制備適合大眾口味的獼猴桃果酒，利用單因素及正交試驗對其發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化，并考察其抗氧化活性，既實現(xiàn)了菌株ZGJ-1的應用開發(fā)，又為獼猴桃的深加工提供了新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）ZGJ-1：中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 化學試劑

蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、苯酚、酒石酸鉀鈉、蔗糖，磷酸二氫鉀、偏重亞硫酸鉀、海藻酸鈉、無水氯化鈣、七水硫酸鎂：國藥集團化學試劑有限公司；果膠酶（20 000 U/g）：北京美的生物技術有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：北京Solarbio公司。試驗所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：麥芽汁1 000 mL，瓊脂20 g，121 ℃高溫滅菌20 min。

酵母增殖培養(yǎng)液[6-7]：葡萄糖10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母膏10.0g、七水硫酸鎂0.2g、磷酸二氫鉀0.2 g，蒸餾水1000 mL，pH 5.0，115 ℃高溫滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

SYQ-DSX-280D高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；THZ-C恒溫振蕩器：江蘇太倉市實驗設備廠；SW-CJ-2D凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；WFJ7200可見分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；PYX-190S-A恒溫培養(yǎng)箱：廣東韶關科力實驗儀器公司；PHS-C酸度計：上海宇隆儀器有限公司；1049酒精計：余姚儀表二廠有限責任公司；TG16-WS高速離心機：長沙平凡儀器儀表有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 游離酵母ZGJ-1制備獼猴桃果酒的工藝流程

1.3.2 固定化酵母ZGJ-1制備獼猴桃果酒工藝流程

1.3.3 操作要點

獼猴桃果汁原液的制備：挑選成熟度較好的獼猴桃，清洗果皮，去皮后按10%的比例加水榨汁，采用果膠酶澄清過濾，果膠酶使用前按果膠酶∶水=1∶10的比例，采用35 ℃水活化30 min，然后按0.25%比例添加于果漿中混合均勻，靜置酶解12 h。加蔗糖、檸檬酸等[8]（符合GB 2760—2011《食品添加劑使用標準規(guī)定》），調整果汁pH（3.0～4.0）、起始糖度200 g/L，將制備的果汁原液分裝到500 mL發(fā)酵瓶中（裝液量70%），發(fā)酵瓶標注游離與固定化，置于95 ℃滅菌15 min，再冷卻至常溫，待用。

酵母菌ZGJ-1的活化：取28 ℃培養(yǎng)48 h的斜面菌，用無菌水將菌苔洗下，倒入裝有玻璃珠的無菌三角瓶中，充分振蕩制成菌懸液，使菌懸液的細胞濃度達到（1.8～2.6）×108個/mL。取5%菌懸液加入滅菌增殖培養(yǎng)液中，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)32～36 h，得到酵母菌ZGJ-1的活化液。

海藻酸鈉溶液2%（包埋劑）[9]：稱取1.0 g海藻酸鈉，用少量去離子水調成糊狀，再加水至40 mL，適當加熱溶化，分裝到小燒杯10 mL，0.1 MPa滅菌15 min后，冷卻至45 ℃?zhèn)溆谩?/p>

CaCl2溶液（誘導劑）[10-11]：稱取無水氯化鈣1.5g，用100mL去離子水溶解，并分裝于2個250 mL錐形瓶中，0.1 MPa滅菌15 min，冷卻備用。

酵母細胞的固定化[12]：無菌狀態(tài)下，取菌液加入包埋劑中，混勻，凝膠內包埋菌量為（3.8～4.6）×107個/mL；用無菌滴管緩慢而穩(wěn)定的速度滴入50 mL的氯化鈣溶液中，邊滴邊搖晃錐形瓶，制得直徑約為3 mm的凝膠珠；在誘導劑中鈣化30 min，用無菌漏勺濾出，用無菌水沖洗3次，即可倒入裝有發(fā)酵液的對應發(fā)酵瓶中，用保鮮膜封口。

接種、前酵：按200 g/L的比例添加蔗糖將果汁總糖進行調節(jié)，將游離與固定化酵母菌種ZGJ-1分別接入已滅過菌的果汁液中，接種比例控制在1%～10%，發(fā)酵瓶蓋密封口，維持起始溫度25 ℃靜置培養(yǎng)、前酵時間約4～6 d，以糖度的下降量監(jiān)測發(fā)酵的進程，72 h后將溫度提高至28 ℃，隨著發(fā)酵時間的延長，記錄對發(fā)酵能力的影響程度。

后發(fā)酵：當酒精度達到8%vol時，終止前發(fā)酵，調整發(fā)酵溫度為16 ℃進入后發(fā)酵階段，直至總糖含量降至40 g/L終止發(fā)酵。

陳釀：將發(fā)酵液進行倒罐，于5 ℃條件下陳釀3個月。

澄清、過濾：將陳釀的酒分離得到酒腳，加入適量皂土進行澄清過濾。

滅菌：于75 ℃條件下滅菌15 min，得到獼猴桃果酒成品。

1.3.4 獼猴桃果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗

采用游離酵母及固定化酵母分別制備獼猴桃果酒，在單因素試驗基礎上，以酒精度及殘?zhí)呛繛樵u價指標，用正交試驗考察SO2添加量（A）、酵母接種量（B）、起始糖度（C）對獼猴桃果酒品質的影響，優(yōu)化果酒發(fā)酵工藝，正交試驗因素與水平見表1。

表1 獼猴桃果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for kiwifruit wine fermentation technology optimization

1.3.5 質量檢測

獼猴桃果酒感官指標、理化指標測定按照國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；微生物指標測定按照國標GB 4789—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》；其他指標測定參照獼猴桃果酒的行業(yè)標準QB/T 2027—1994《獼猴桃酒》。

1.3.6 抗氧化能力的測定

（1）羥自由基（·OH）清除率的測定

按照文獻[13-14]進行測定，羥基自由基清除率計算公式如下：

式中：A0為未加酒樣的測定值；A1為加酒樣的測定值；A2為果酒本底測定值。

（2）超氧陰離子自由基（O2-·）清除率的測定

按照文獻[15-16]進行測定，超氧陰離子自由基清除率計算公式如下：

式中：A0為空白樣吸光度值；AS為待測樣品吸光度值。

（3）DPPH自由基（DPPH·）清除率的測定

按照文獻[17-18]進行測定，DPPH自由基清除率計算公式如下：

式中：A0為對照的吸光度值；A1為樣品反應體系的吸光度值；A2為果酒本底吸光度值。

2 結果與分析

2.1 酵母菌ZGJ-1產(chǎn)酒能力測定

酵母菌種的發(fā)酵性能直接影響果酒品質，用發(fā)酵能力和繁殖能力較高、抗SO2能力較強的酵母啟動發(fā)酵，可提高酒精發(fā)酵速率，而且釀造的果酒品質好[3]。如圖1所示，當采用5%的接種量將游離與固定化酵母分別接種于滅過菌的果汁液中，維持25 ℃恒溫發(fā)酵時，固定化酵母菌較游離酵母遲緩期的時間要短，72 h后將溫度提高至28 ℃，此時固定化酵母進入主酵速度更快，產(chǎn)能代謝物更多。結果表明，固定化酵母發(fā)酵所產(chǎn)酒精含量高，產(chǎn)率大，菌種的發(fā)酵特性好。

圖1 游離與固定化菌種對獼猴桃果酒酒精度的影響Fig.1 Effects of free and immobilized strains on alcohol content of kiwifruit wine

2.2 酵母ZGJ-1發(fā)酵全汁獼猴桃果酒工藝參數(shù)確立的試驗結果

2.2.1 游離酵母ZGJ-1發(fā)酵獼猴桃汁最佳發(fā)酵工藝參數(shù)

表2 游離酵母ZGJ-1發(fā)酵獼猴桃汁工藝優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization of kiwifruit juice with free yeast ZGJ-1

由表2可知，SO2添加量、酵母接種量和起始糖度均對獼猴桃果酒的酒精度、殘?zhí)呛康戎笜水a(chǎn)生了較為顯著的影響，影響順序為B＞A＞C，即酵母接種量＞SO2添加量＞起始糖度。以酒精度及殘?zhí)呛繛樵u價指標，最佳發(fā)酵工藝組合為A2B2C1，即SO2添加量100 mg/L、酵母接種量5%和起始糖度200 g/L。在此最佳發(fā)酵工藝條件下，獼猴桃果酒酒精度8.3%vol，殘?zhí)?5.64 g/L，且酒體色澤均勻、品嘗適口。

2.2.2 固定化酵母ZGJ-1發(fā)酵獼猴桃汁最佳發(fā)酵工藝參數(shù)

表3 固定化酵母ZGJ-1發(fā)酵獼猴桃汁工藝優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization of kiwifruit juice with immobilized yeast ZGJ-1

續(xù)表

由表3可知，各因素對酒精度及殘?zhí)呛康挠绊戫樞驗锳＞B＞C，以酒精度及殘?zhí)呛繛樵u價指標，正交試驗得到的最優(yōu)發(fā)酵工藝組合為A2B2C1，即SO2添加量100 mg/L、酵母接種量5%和起始糖度200 g/L。在此工藝參數(shù)下，釀造所得獼猴桃果酒酒精度為9.6%vol，殘?zhí)菫?2.28 g/L，且具有獼猴桃清新的果香和醇厚、清雅、諧調的酒香，口感清爽。

2.3 固定化酵母ZGJ-1發(fā)酵獼猴果酒產(chǎn)品的質量檢測

由以上試驗結果顯示，固定化酵母ZGJ-1發(fā)酵獼猴桃汁比游離酵母ZGJ-1發(fā)酵獼猴桃汁的酒精度、口感、色澤均更好。在發(fā)酵工藝條件為SO2添加量100 mg/L、起始糖度200 g/L，滅菌后按5%接種酵母進入前酵。起酵溫度25 ℃，主酵溫度28 ℃，當酒精度達到8%vol時，終止前發(fā)酵，調整發(fā)酵溫度為16 ℃進入后酵階段，直至總糖含量降至40 g/L終止發(fā)酵。進一步將發(fā)酵液進行倒罐，于5 ℃條件下陳釀3個月，分離得到酒腳，加入適量皂土進行澄清過濾，于75 ℃條件下滅菌15 min，得到獼猴桃果酒成品，取樣進行檢測，獼猴桃果酒質量檢測結果見表4～6。

表4 獼猴桃果酒感官評價結果Table 4 Sensory evaluation results of kiwifruit wine

表5 獼猴桃果酒理化指標檢測結果Table 5 Determination results of physicochemical indicators of kiwifruit wine

表6 獼猴桃果酒微生物指標檢測結果Table 6 Determination results of microorganism indictors of kiwifruit wine

由表4～6可知，獼猴桃果酒感官指標、理化指標、微生物指標均滿足相關國標要求。

2.4 固定化酵母發(fā)酵的果酒成品抗氧化能力測定結果

DPPH能形成穩(wěn)定的醇溶性自由基，自由基清除劑存在時可與DPPH自由基單電子配對，使其在波長517 nm處的吸收逐漸消失，與乙醇溶液形成的深紫色變淺，其褪色程度與其接受的電子數(shù)成線性關系，從而評價出樣品的抗氧化能力[19-20]。由圖2可知，采用的3種抗氧化評價方法，其顯示的評價結果有一定差異。綜合來看，獼猴桃果酒的抗氧化能力是最高的，對·OH、DPPH·及O2-·清除率分別為42%、96%、80%。

圖2 獼猴桃果酒的抗氧化能力檢測結果Fig.2 Determination results of antioxidant capacity of kiwifruit wine

3 結論

當固定化與游離酵母菌ZGJ-1對獼猴桃全汁進行發(fā)酵，其固定化酵母菌進行發(fā)酵的果酒品質明顯優(yōu)于游離酵母菌發(fā)酵，且最優(yōu)參數(shù)為SO2添加量100 mg/L、起始糖度200 g/L，后按照200 g/L的比例添加蔗糖將果汁總糖進行補充調節(jié)并滅菌，固定化酵母接種量5%時所獲得的獼猴桃果酒酒精度≥8%vol，具有典型清爽的獼猴桃果香和濃郁的酒香，口味純正柔和，風格獨特，具有較好的抗氧化能力。

隨著對釀酒酵母ZGJ-1在果酒領域的市場開發(fā)，將有效解決市場上專用發(fā)酵菌種缺乏、產(chǎn)品風味不穩(wěn)定、產(chǎn)品質量不穩(wěn)定，比如酒體顏色加重、氧化感增加、果香變淡，失光、沉淀等現(xiàn)象，也將為果農(nóng)增收、社會生態(tài)等產(chǎn)生效益。