楊曉亮 邵新中 劉寧 于亞東 于曉飛

缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)是斷肢再植術(shù)后血管痙攣或血栓形成的始動(dòng)因素之一[1,2]，可損傷遠(yuǎn)隔器官，進(jìn)一步演變?yōu)槿硌仔苑磻?yīng)綜合征，甚至多器官功能衰竭，威脅患者生命安全。如何緩解肢體IRI，降低致殘率、病死率已成為臨床研究熱點(diǎn)之一。相關(guān)研究表明，能量代謝障礙、鈣離子超載、氧自由基釋放等可能在斷肢再植后IRI中發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[3,4]。另有學(xué)者指出，細(xì)胞凋亡是IRI的重要病理改變[5]。依達(dá)拉奉可有效抑制氧自由基對機(jī)體損傷，防止細(xì)胞凋亡，但部分?jǐn)嘀僦埠驣RI患者整體療效不太樂觀。近年來，中藥憑借多靶點(diǎn)、多途徑等優(yōu)勢在IRI治療中廣受臨床關(guān)注。復(fù)方丹參滴丸是一種純中藥復(fù)方制劑，具有活血化瘀、理氣止痛的功效，有助于提高機(jī)體抗缺氧能力、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈[6,7]。但關(guān)于復(fù)方丹參滴丸聯(lián)合依達(dá)拉奉對斷肢再植后IRI患者凋亡蛋白水平的干預(yù)效果有待進(jìn)一步商榷?；诖?，本研究首次采用復(fù)方丹參滴丸聯(lián)合依達(dá)拉奉治療，探討其對斷肢再植后IRI患者氧化應(yīng)激、凋亡蛋白的影響。具體分析如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2019年9月我院156例斷肢再植后IRI患者作為研究對象，簡單隨機(jī)化分組，每組78例。2組基本資料[性別比、年齡、體重指數(shù)(BMI)、受傷至手術(shù)時(shí)間、手術(shù)用時(shí)、肢體縮短、受傷原因、受傷部位]差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組一般資料比較 n=78

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合斷肢再植術(shù)指征者；②受傷至手術(shù)時(shí)間<8 h；③本研究均經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，且患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①凝血機(jī)制紊亂或活動(dòng)性出血者；②合并肝腎等重要臟器器質(zhì)性病變者；③處于妊娠期、產(chǎn)褥期或哺乳期等特殊時(shí)期者；④既往有復(fù)方丹參滴丸、依達(dá)拉奉等藥物過敏史者；⑤合并顱腦、胸腹臟器損傷者；⑥肢體軟組織>肢體橫斷面的1/4者；⑦合并血管損傷的開放性復(fù)合傷者；⑧殘留皮膚>肢體周徑的1/8者；⑨合并肢體血栓閉塞性血管病變或原發(fā)性深靜脈瓣膜病變者；⑩精神行為異常者。

1.3 方法 2組均實(shí)施斷肢再植術(shù)，術(shù)后配合相關(guān)治療。

1.3.1 對照組:術(shù)后靜脈滴注0.5 mg/kg依達(dá)拉奉(山東新華制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20203037)加入100 ml氯化鈉溶液(0.9%)，2次/d。

1.3.2 觀察組:在對照組基礎(chǔ)上口服復(fù)方丹參滴丸(天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z10950111)治療，250 mg/次，3次/d。2組于治療10 d后評估相關(guān)結(jié)果。

1.4 觀察指標(biāo) (1)比較2組術(shù)后斷肢再植成活率及斷肢血管危象發(fā)生率。(2)采用全自動(dòng)血凝分析儀(型號：CS-5100，購自德國西門子公司)檢測比較治療前、治療第3、10天凝血功能[活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)]。(3)比較治療前、治療第3、10天2組血清SOD、MDA水平。(4)比較治療前、治療第3、10 d 2組Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白水平。(5)統(tǒng)計(jì)2組不良反應(yīng)(頭暈頭痛、皮疹、胃腸道反應(yīng))發(fā)生率。(6)采用Fugl-Meyer運(yùn)動(dòng)功能測評法(Fugl-Meyer Assessment of MotorFunction，F(xiàn)MA)[8]評估2組治療前、治療后6個(gè)月肢體功能，總分0～100分，其中<50分為Ⅰ級(嚴(yán)重運(yùn)動(dòng)障礙)，50～84分為Ⅱ級(明顯運(yùn)動(dòng)障礙)，85～95分Ⅲ級(中度運(yùn)動(dòng)障礙)，96～99分為Ⅳ級(輕度運(yùn)動(dòng)障礙)。

1.5 檢測方法 (1)空腹取3 ml靜脈血，3 000 r/min離心10 min，分離取血清，置于-70℃冰箱低溫保存，采用比色法檢測血清丙二醛(MDA)水平，采用黃嘌呤氧化酶法檢測血清超氧化物歧化酶(SOD)，試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書。(2)采用免疫組化法檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白，兔抗人Bcl-2、Bax、Caspase-3單克隆抗體購自上海莼試生物技術(shù)有限公司，具體方法：取中性甲醛固定組織標(biāo)本，制成連續(xù)切片(厚度為3 μm)。二甲苯脫蠟、梯度無水乙醇水化，檸檬酸緩沖液修復(fù)抗原，滴加過氧化氫(3.0%)1滴離去離子，水室溫孵15 min，緩沖液反復(fù)沖洗3次；滴加山羊血清1滴封閉15 min，棄去血清，緩沖液沖洗1次。分別滴加Bcl-2抗體、Bax抗體、Caspase-3抗體，孵育8 h，溫度控制在4℃。次日以緩沖液沖洗切片3次，后滴加生物素標(biāo)記的羊抗小鼠IgM二抗，室溫條件下孵育20 min，3,3′-二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片，顯微鏡下檢查。

2 結(jié)果

2.1 臨床療效指標(biāo) 觀察組術(shù)后斷肢再植成活率(97.44%)及斷肢血管危象發(fā)生率(3.85%)與對照組(93.59%、2.56%)相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 2組臨床療效指標(biāo)比較 n=78,例(%)

2.2 凝血功能 2組治療前APTT、TT相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；組間比較，觀察組治療第3天、10天APTT、TT低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同時(shí)間點(diǎn)比較，2組APTT、TT先升高再降低，并于治療第3天達(dá)到峰值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組凝血功能指標(biāo)比較

2.3 血清SOD、MDA水平 2組治療前血清SOD、MDA水平相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；組間比較，觀察組治療第3天、10天血清SOD水平高于對照組，血清MDA水平低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同時(shí)間點(diǎn)比較，2組血清SOD水平先降低再升高、血清MDA水平先升高再降低，并均于治療第3 d達(dá)到峰值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 2組血清SOD、MDA水平比較

2.4 Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白水平 2組治療前外周血Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；組間比較，觀察組治療第3天、10天外周血Bcl-2蛋白表達(dá)高于對照組，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；不同時(shí)間點(diǎn)比較，2組Bcl-2蛋白表達(dá)先降低再升高、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)先升高再降低，并均于治療第3天達(dá)到峰值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 2組Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白水平比較

2.5 不良反應(yīng)發(fā)生率 觀察組不良反應(yīng)發(fā)生率(12.82%)與對照組(8.97%)對比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表6。

2.6 肢體功能 2組治療前肢體功能評分相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后6個(gè)月2組肢體功能評分較治療前升高(P<0.05)；觀察組治療后6個(gè)月肢體功能評分高于對照組(P<0.05)。見表7。

表7 2組肢體功能評分比較 n=78,分,

3 討論

文獻(xiàn)指出，斷肢再植后IRI發(fā)生是一個(gè)多因素參與、多機(jī)制損傷的過程[9]，目前臨床尚未完全明確其發(fā)病機(jī)制，研究認(rèn)為，其與氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化存在密切聯(lián)系[10,11]。因此，減少氧自由基產(chǎn)生是減輕斷肢再植后IRI、促進(jìn)缺血肢體血液供應(yīng)恢復(fù)、維持肢體存活及功能的重要環(huán)節(jié)。依達(dá)拉奉屬新型自由基清除劑，通過電子直接清除羥自由基，可清除自由基，抑制細(xì)胞膜過氧化連鎖反應(yīng)，進(jìn)而有效減輕血管內(nèi)細(xì)胞氧自由基損傷[12]，但單一用藥治療效果不甚理想，可能引發(fā)血小板減少、皮疹等不良反應(yīng)。

復(fù)方丹參滴丸主要由丹參、三七、冰片等成分組成，其中丹參味苦，微寒，歸心、心包、肝經(jīng)，可活血調(diào)經(jīng)，祛瘀止痛，涼血消癰，除煩安神；三七性甘、微苦，溫，歸肝、胃經(jīng)，能化瘀止血，活血定痛；冰片辛，苦，微寒，歸心、脾、肺經(jīng)，有清熱止痛之功，諸藥共奏祛瘀止痛的功效。戢艷瓊等[13]通過136例行經(jīng)皮冠脈動(dòng)脈介入術(shù)治療的急性心肌梗死患者發(fā)現(xiàn)，術(shù)后應(yīng)用復(fù)方丹參滴丸，有助于降低術(shù)后IRI，是防治急性心肌梗死后心力衰竭、改善預(yù)后的關(guān)鍵。另外，楊曉亮等[14]研究顯示，受炎性因子及巨噬細(xì)胞大量分泌影響，斷指再植術(shù)后患者斷指部位易發(fā)生血管痙攣情況，影響機(jī)體凝血及纖溶系統(tǒng)，隨時(shí)間延長可引發(fā)缺血，增加術(shù)后手指血管危象發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。在此基礎(chǔ)上，本研究針對斷肢再植后IRI患者首次采用復(fù)方丹參滴丸聯(lián)合依達(dá)拉奉治療，結(jié)果顯示，二者聯(lián)合對斷肢再植成活率及斷肢血管危象發(fā)生率的影響小，有助于減少術(shù)后凝血功能異?！，F(xiàn)代藥理研究表明，三七富含三七總皂苷成分，具有顯著體內(nèi)外抗抑制血小板聚集、抗血栓形成作用[15]，與依達(dá)拉奉聯(lián)合，利于防止凝血機(jī)制異常，降低血栓發(fā)生率。

同時(shí)，研究證實(shí)氧自由基是造成IRI的重要因素，也是IRI的重要發(fā)病環(huán)節(jié)，不僅可損傷線粒體，引發(fā)呼吸傳遞鏈功能異常，增加電子漏[16]，還能活化大量單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞，上調(diào)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá)，釋放過量一氧化氮，進(jìn)而發(fā)生鎖鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，誘導(dǎo)持續(xù)損傷。MDA是自由基所致脂質(zhì)過氧化終末代謝產(chǎn)物，其水平升高可間接反映氧自由基生成及其所致組織細(xì)胞損傷程度，體現(xiàn)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)。SOD是反映組織內(nèi)氧自由基水平及脂質(zhì)過氧化程度的重要指標(biāo)之一，可間接反映機(jī)體氧自由基清除能力。李倩等[17]研究顯示，心肌缺血再灌注損傷發(fā)生與內(nèi)源性氧自由基清除劑SOD活性下降、氧自由基MDA含量升高存在一定關(guān)系。本研究數(shù)據(jù)表明，復(fù)方丹參滴丸聯(lián)合依達(dá)拉奉有助于調(diào)節(jié)斷肢再植后IRI患者氧化應(yīng)激，這可能是由于復(fù)方丹參滴丸中富含丹參素、維生素E及硒等成分，可增強(qiáng)SOD及谷胱甘肽過氧化物活性，啟動(dòng)內(nèi)源性抗氧化反應(yīng)，抑制氧化應(yīng)激損傷，與依達(dá)拉奉聯(lián)合可發(fā)揮良好協(xié)同作用，進(jìn)一步增強(qiáng)SOD活性，抑制MDA釋放，保護(hù)骨骼肌組織正常灌注，抑制軟骨組織退行性改變，從而對斷肢再植后IRI患者骨骼肌發(fā)揮良好保護(hù)作用。

另外，大量骨骼肌細(xì)胞凋亡是斷肢再植后IRI最主要分子生物學(xué)變化，而Bax是一種促凋亡基因，與Bcl-2相互作用可調(diào)控細(xì)胞正常凋亡過程，二者比值改變可作為反映細(xì)胞對凋亡信號的應(yīng)答的輔助指標(biāo)之一[18]。Caspase-3是多條凋亡通路聯(lián)系因子，可直接或間接參與凋亡蛋白產(chǎn)生，引發(fā)細(xì)胞凋亡，白建偉等[19]研究表明，胃癌患者細(xì)胞總凋亡率逐漸增加與線粒體凋亡通路中Bax、Caspase-3分子激活有關(guān),可為胃癌臨床化療方案提供新的探索。同時(shí)線粒體損傷可能也是缺血再灌注誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要因素，而Bcl-2主要分布于線粒體膜上，不僅可維持線粒體正常功能、抑制凋亡因子外溢，還能抑制鈣離子釋放，發(fā)揮良好抗氧化劑作用。本研究通過對比研究可見，復(fù)方丹參滴丸聯(lián)合依達(dá)拉奉調(diào)節(jié)斷肢再植后IRI患者Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白水平優(yōu)于依達(dá)拉奉單一治療。分析機(jī)制在于，復(fù)方丹參滴丸中丹參酮IIA下調(diào)Fas基因及其配體FasL蛋白表達(dá)，可達(dá)到抑制細(xì)胞增殖活性、改變呈曲型細(xì)胞凋亡的目的，與依達(dá)拉奉聯(lián)合，能調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax表達(dá)平衡，抑制肢體缺血再灌注后骨骼肌細(xì)胞凋亡，減輕肢體IRI。進(jìn)一步研究表明，復(fù)方丹參滴丸聯(lián)合依達(dá)拉奉具有一定安全性，能有效改善斷肢再植后IRI患者肢體功能，可能與機(jī)體氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡改善有關(guān)。