張志坤,蒲曉輝 ,袁 琦

河南大學(xué) 藥物研究所,河南 開(kāi)封 475004

喜樹(shù)堿(camptothecin,CPT)主要是從植物喜樹(shù)中提取并分離出來(lái)的,是具備較強(qiáng)生物學(xué)活性的生物堿。羥基喜樹(shù)堿(hydroxycamptothecin,HCTP) 作為喜樹(shù)堿(CPT)的類(lèi)似物,是從喜樹(shù)中提取出來(lái)的,并且有更強(qiáng)的抗腫瘤效果[1],對(duì)肝癌、胃癌、直腸癌、宮頸癌等均有比較好的效果[2-3]。槲皮素(quercetin,QUR)是一種天然黃酮[4],具有抗炎、抗氧化、抗微生物、免疫調(diào)節(jié)和抗癌[5-8]等藥理作用。相關(guān)研究[9]表明,槲皮素具有良好的逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性的作用,主要是可以降低多藥耐藥相關(guān)蛋白過(guò)度表達(dá)的腫瘤細(xì)胞對(duì)腫瘤藥物的外排作用。

目前,使用單一藥物治療癌癥經(jīng)常會(huì)產(chǎn)生耐藥性,影響其治療效果。聯(lián)合用藥可以在一定程度上緩解腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的問(wèn)題。羥基喜樹(shù)堿具有良好的抗腫瘤活性,但同時(shí)也有較強(qiáng)的毒副作用。因此,羥基喜樹(shù)堿常常采用聯(lián)合用藥的方式用于抗腫瘤治療。如羥基喜樹(shù)堿與鉑類(lèi)化合物[10]、抗代謝類(lèi)抗腫瘤藥、其他抗腫瘤藥物等多種藥物聯(lián)合用藥。本實(shí)驗(yàn)在前期制劑研究中,選用了羥基喜樹(shù)堿和槲皮素作為模型藥物,聯(lián)合應(yīng)用于腫瘤的治療。并同時(shí)建立測(cè)定納米混懸劑中羥基喜樹(shù)堿和槲皮素的含量測(cè)定方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

羥基喜樹(shù)堿原料藥99%(湖北黃石飛云制藥);槲皮素原料藥98%(南京景竹生物科技有限公司);色譜甲醇(天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

分析天平(上海鼎科科學(xué)儀器有限公司);W2695型高效液相色譜儀(北京京科瑞達(dá)科技有限公司);UV-2600日本島津公司紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器有限公司);0.45 μm 無(wú)菌濾膜(天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

分別稱(chēng)取10 mg羥基喜樹(shù)堿標(biāo)準(zhǔn)品和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品及空白納米混懸劑,用甲醇進(jìn)行溶解,在25 mL 棕色容量瓶中定容后作為供試品。取約2 mL的甲醇溶液作為空白對(duì)照,在200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描,確定最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1 所示,羥基喜樹(shù)堿在222、266、384 nm處吸光度最大,而槲皮素有兩個(gè)最大吸收,分別在255 nm 和374 nm 處。并且可以觀察到羥基喜樹(shù)堿和槲皮素在374 nm 附近均有較強(qiáng)吸收,且在374 nm 波長(zhǎng)處可以有效避免末端吸收和空白材料的干擾。所以,本實(shí)驗(yàn)選擇374 nm 處作為藥物的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 紫外波長(zhǎng)掃描圖

2.2 色譜條件

色譜柱:Sino Chrom ODS-BP色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇-水(60∶40);檢測(cè)波長(zhǎng)374 nm,柱溫30 ℃;流速1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量20 μL。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別從濃度為25.3 μg·mL-1的羥基喜樹(shù)堿和25.5 μg·mL-1的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液中精密量取10 mL轉(zhuǎn)移至25 mL棕色容量瓶中,使用色譜甲醇進(jìn)行定容并搖勻,得到濃度為10.12 μg·mL-1的羥基喜樹(shù)堿和10.2 μg·mL-1的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液作為母液。精密量取羥基喜樹(shù)堿儲(chǔ)備液,加色譜甲醇稀釋為0.506、1.012、2.024、3.036、4.048、5.06、7.59、10.12 μg·mL-1的羥基喜樹(shù)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取槲皮素儲(chǔ)備液,加甲醇稀釋為0.51、1.02、2.04、3.06、4.08、5.1、7.65、10.2 μg·mL-1的 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照2.2色譜條件進(jìn)樣,測(cè)定。以藥物濃度為橫坐標(biāo),以峰面積為縱坐標(biāo),繪制線性回歸方程。羥基喜樹(shù)堿的線性回歸方程為:Y=81 268X-10 761(R2=0.999 9),線性范圍為0.506～10.12 μg·mL-1;槲皮素的線性回歸方程為:Y=67 343X-8 960.3(R2=0.999 9),線性范圍為0.51～10.2 μg·mL-1。由R值可知,羥基喜樹(shù)堿和槲皮素在線性范圍內(nèi),色譜峰面積與藥物濃度均有很好的線性關(guān)系。

2.4 專(zhuān)屬性考察

分別對(duì)空白溶劑、羥基喜樹(shù)堿及槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品、樣品按照2.2色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣。

在實(shí)驗(yàn)選定的色譜條件下,羥基喜樹(shù)堿A 保留時(shí)間t=6.985 min,槲皮素保留時(shí)間t=8.879 min,在374 nm 波長(zhǎng)處兩者峰型較好,并且羥基喜樹(shù)堿和槲皮素可以很好的分離?？瞻兹軇?duì)羥基喜樹(shù)堿以及槲皮素的測(cè)定無(wú)干擾。可以說(shuō)明該方法專(zhuān)屬性良好,能夠滿足分析方法的要求。

2.5 精密度試驗(yàn)

分別取10.12 μg·mL-1羥基喜樹(shù)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液,和10.2 μg·mL-1槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液各6份。當(dāng)天進(jìn)行測(cè)定,帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算其濃度的RSD 值,考察日內(nèi)精密度;隔天再次對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定,帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算其濃度的RSD 值,考察日間精密度。精密度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。日內(nèi)和日間精密度得RSD值均小于1.16%,說(shuō)明該方法具有良好的精密度,能夠滿足樣品分析學(xué)的要求。

表1 日內(nèi)與日間精密度的結(jié)果(n=6)

2.6 回收率試驗(yàn)

回收率試驗(yàn)主要從方法回收率和加樣回收率兩個(gè)方面進(jìn)行考察。分別取高、中、低3個(gè)不同濃度的羥基喜樹(shù)堿和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液,根據(jù)2.2色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,考察其方法回收率。精密稱(chēng)取空白材料適量,然后按照制劑含量的80%、100%、120%,分別加入適量羥基喜樹(shù)堿和槲皮素原料藥,用甲醇稀釋定容并搖勻,進(jìn)樣測(cè)定,考察加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同濃度方法回收率測(cè)定結(jié)果(n=3)

由表2可知,羥基喜樹(shù)堿和槲皮素在低、中、高3種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液方法回收率均在98.63%～100.54%之間,RSD 值小于0.32%,表明該方法回收率較好。加樣回收率進(jìn)行考察,結(jié)果見(jiàn)表3及表4。其回收率在98.59%～101.89%之間,RSD 值均小于1.73%,說(shuō)明該方法加樣回收率較好。

表3 羥基喜樹(shù)堿加樣回收率結(jié)果(n=3)

表4 槲皮素加樣回收率結(jié)果(n=3)

3 討論

在抗腫瘤治療中,為了緩解耐藥性的問(wèn)題,聯(lián)合用藥成為當(dāng)下的熱點(diǎn)。一方面可以緩解藥物的耐藥性,另一方面可以在降低毒副作用的同時(shí)提高藥物的治療效果。但是,聯(lián)合用藥樣品的含量測(cè)定需要同時(shí)兼顧兩種藥品。而建立一種方便、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度較高的測(cè)定方法,可以更好地推進(jìn)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展。

本研究以羥基喜樹(shù)堿和槲皮素作為模型藥物,制備成納米混懸劑,使其用于抗腫瘤的治療。采用高效液相色譜法建立納米混懸劑中羥基喜樹(shù)堿和槲皮素的含量測(cè)定方法。對(duì)色譜條件進(jìn)行選擇,羥基喜樹(shù)堿是一類(lèi)色氨酸-萜稀類(lèi)生物堿,色譜法容易出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象,最終確定流動(dòng)相使用甲醇-水(60∶40)的比例時(shí),可以較好地改善拖尾現(xiàn)象。

在線性范圍內(nèi)建立的兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線有較好的線性關(guān)系,對(duì)其方法專(zhuān)屬性、精密度、回收率進(jìn)行考察,結(jié)果表明,建立的含量測(cè)定方法較簡(jiǎn)便、專(zhuān)屬性較好、可靠、準(zhǔn)確度較高,可以用作納米混懸劑中羥基喜樹(shù)堿和槲皮素的含量測(cè)定。