李科， 張琳， 劉福亮， 賈艷琨

(自然資源部地下水科學與工程重點實驗室， 中國地質科學院水文地質環(huán)境地質研究所，河北 正定 050803)

碳、氮元素作為生物生存必須的元素，是組成生態(tài)系統(tǒng)的骨架。天然體中存在著大量碳、氮元素及其化合物，隨著物理和化學作用等天然條件的改變，引起它們的同位素比微量改變即同位素分餾，這種微量變化是認識天然體中物質變化的最好信息。穩(wěn)定碳同位素廣泛應用于探討各種生態(tài)環(huán)境中的物質來源和遷移規(guī)律[1-3]，氮同位素則反映了不同物源的貢獻[4-5]，作為生態(tài)環(huán)境研究的示蹤劑，碳、氮同位素可以提供非常重要的信息及人類活動記錄，在水中顆粒物、污泥、海洋沉積物、植物、土壤、第四紀等領域的研究愈加廣泛[6-12]。碳、氮穩(wěn)定同位素的分析已越來越廣泛地用于同位素化學、生物化學、環(huán)境科學、地球化學、礦物學和宇宙化學等[13-17]。

碳、氮同位素國際標準物質由國際原子能機構(IAEA)研制并向世界范圍內的相關實驗室發(fā)放，因其制備數(shù)量有限，幾種主要碳氮同位素國際標準物質現(xiàn)已耗盡，IAEA倡導各國研制與國際標準相聯(lián)系的自己國家的同位素標準物質，美國、日本[18]等很多國家都研制了與國際標準VPDB和Air-N2相聯(lián)系的碳、氮同位素標準物質，滿足本國科研需求。在我國有證標準物質中，20世紀80年代末期由中國石油勘探開發(fā)科學研究院研制了炭黑國家一級標準物質(GBW04407、GBW04408)，用于有機質碳同位素的測定。炭黑由近乎100%純碳組成，更適用于石油等領域高碳含量樣品測試。而環(huán)境中復雜成分的有機物質，由于其碳含量(如土壤、沉積物等樣品)相對較低，之前的國家標準物質已經不能滿足當前各實驗室生態(tài)環(huán)境樣品研究需求。隨著實驗儀器的發(fā)展進步，碳、氮同位素可以同時檢出，而我國尚無氮同位素標準物質，研制與國際標準VPDB和Air-N2相聯(lián)系的碳、氮同位素標準物質成為我國同位素技術應用工作所面臨的一項緊迫任務。

國際上新近開展的同位素標準研制工作，皆使同位素組成形成系列，且差別更小，以提高量值傳遞精度。根據(jù)國際同位素研究學科發(fā)展趨勢和有機質碳氮同位素標準物質研究現(xiàn)狀，本項目組按照我國環(huán)境樣品中碳氮穩(wěn)定同位素含量范圍[6-8]，完成了涵蓋我國天然環(huán)境碳氮穩(wěn)定同位素端值的呈梯度分布的4個有機質碳、氮同位素標準物質，采用目前國際廣泛應用的高溫燃燒-氣體同位素質譜法在線連續(xù)流分析技術[19-21]，開展均勻性、穩(wěn)定性檢驗及定值，以適應新方法新技術的需求，滿足不同環(huán)境樣品碳、氮穩(wěn)定同位素分析研究需求。

1 實驗部分

1.1 候選物的采集和制備

本次標準物質與國際標準相聯(lián)系，所選的候選物包括了物理性質不同的易溶于水的尿素和微溶于水的L-谷氨酸，兩種有機物在室溫條件下非常穩(wěn)定。選擇的有機質穩(wěn)定、均勻，有足夠量，能夠保證長期保存，兩種有機物C與N摩爾比不同，可滿足不同生態(tài)樣品分析需求。

根據(jù)生態(tài)系統(tǒng)中碳、氮同位素值組成的區(qū)間值δ13C值為-40‰～0‰，δ15N值為-10‰～30‰，確定了本項目研制的系列碳氮同位素標準物質同位素值區(qū)間。通過對大量商用試劑候選物的測試，篩選出處于δ13C、δ15N負端值的尿素、L-谷氨酸商用分析純作為2個候選物(表1)，通過添加高富集的δ13C、δ15N尿素純品，人工配制另兩種尿素，由此組成呈梯度分布、滿足不同特征值需求的系列(4個)有機物同位素標準品。

表1 碳氮同位素標準物質候選物設計Table 1 Design of candidates for carbon and nitrogen isotopes reference materials

1.2 候選物分裝

在分裝標準前對小瓶進行洗滌(酸洗、水洗)，烘干，滅菌。在盡可能短的時間內將樣品分裝于潔凈的小玻璃瓶中，每瓶裝1g，每種標準樣品分裝1000瓶，從001～1000逐瓶編號。封口后全部樣品放置在裝有硅膠的干燥器中保存，干燥器放置于避光處長期保存。

2 候選物均勻性和穩(wěn)定性檢驗

2.1 候選物均勻性檢驗

每種標準物質隨機抽取25瓶的均勻性子樣，包括子樣中最可能產生污染的分裝過程的前5瓶，然后再隨機抽取子樣20瓶，每份子樣做雙份分析。δ13C、δ15N值選擇經典的高溫燃燒-氣體同位素質譜法進行樣品的均勻性檢驗，按照《標準物質定值的通用原則及統(tǒng)計學原理》(JJF 1343—2012)對測試結果進行方差(單因素F檢驗法)檢驗，4種標準物質的均勻性檢驗得到的F值都小于相應的自由度的臨界值，測試結果(表2)顯示4種標準物質候選物的均勻性良好。

表2 候選物δ13C和δ15N值的均勻性檢驗方差分析結果Table 2 Variance analysis for δ13C and δ15N values homogeneity inspection of reference materials

2.2 候選物穩(wěn)定性檢驗

標準物質的穩(wěn)定性包括短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性。為了獲得具有良好穩(wěn)定性的標準物質，本次研制的系列標準物質的初始階段注意選擇了具有穩(wěn)定性能材料作為標準物質的候選物[22-23]，《標準物質定值的通用原則及統(tǒng)計學原理》(JJF 1343—2012)中5.1短期穩(wěn)定性評估通常在不同溫度條件下進行，以考察溫度對于標準物質待定特性值的影響，此次選擇將4種標準物質在不同溫度(4℃、20℃、35℃、50℃、60℃)下，進行樣品δ13C和δ15N測定。經檢驗，環(huán)境溫度對δ13C和δ15N值無影響，因此本次研制的標準物質可保證標準物質在溫度、運輸過程中的短期穩(wěn)定性。

4種標準物質依據(jù)JJF 1343—2012中5.2要求，進行了長期穩(wěn)定性的研究。在本項目實施的近兩年過程中，結合定值采用高溫燃燒-氣體同位素質譜法進行了5次δ13C和δ15N穩(wěn)定性檢驗，由穩(wěn)定性測試結果(表3)表明，本項目研制的標準物質候選物是穩(wěn)定的。

表3 候選物δ13C和δ15N值的穩(wěn)定性檢驗結果Table 3 Results of for δ13C and δ15N values stability inspection of standard materials

3 特征量值分析及定值

3.1 定值溯源性

本次標準物質量值的定值，采用多個實驗室采用一種或多種準確、可靠的方法協(xié)作測定，強調每個環(huán)節(jié)的量值溯源性，并且利用一切技術手段及組織手段確保分析數(shù)據(jù)的準確度和可靠性。測量δ13C值時，以國際標準IAEA-CH-6、USGS40、USGS41、L-SVEC為測量尺度。測量δ15N值時，以國際標準USGS40、IAEA-N-1、IAEA-N-2、USGS41為測量尺度，采用線性校正[24-26]所定出的δ值就是相對于國際標準VPDB和Air-N2的值。

3.2 定值實驗室

經過對行業(yè)代表性、實驗室技術能力及設備條件等進行綜合考慮，本次標準物質定值，經過前期的盲樣考核后確定了包括研制單位實驗室在內的12家實驗室分別參與協(xié)同定值，參加協(xié)同定值的實驗室為(實驗室編號依次為1～12)：加拿大渥太華大學穩(wěn)定同位素實驗室(University of Ottawa G.G.Hatch Stable Isotope Laboratory)，中國科學院地質與地球物理研究所，河海大學，國家海洋局杭州海洋二所，國家海洋局杭州海洋三所，中國地質科學院青島海洋地質研究所，中國科學院東北地理與農業(yè)生態(tài)研究所，英國Iso-Analytical同位素分析研究中心(Iso-Analytical Stable Isotope Ratio Analysis Laboratory)，英國蘇格蘭大學(Scottish Universities Environmental Research Centre)，中國地質調查局南京地質調查中心，中國農業(yè)科學院農業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所。

3.3 定值元素δ13C的測量方法及結果

本次δ13C值的定值測定是以經典的高溫燃燒-氣體同位素質譜法進行測試，各實驗室的測試儀器不同。根據(jù)Reference materials—General and statistical principles for certification(ISO Guide 35)和《標準物質定值的通用原則及統(tǒng)計學原理》(JJF 1343—2012)規(guī)定，δ13C定值實驗組數(shù)為10組(表4)。

表4 各實驗室δ13C值的分析方法和分析數(shù)據(jù)Table 4 Multiple measurement data of δ13C for the four reference materials

3.4 定值元素δ15N值的測量方法及結果

本次δ15N值的定值是采用經典的高溫燃燒-氣體同位素質譜法進行測試，各實驗室的測試儀器不同。根據(jù) ISO Guide 35和JJF 1343—2012規(guī)定，δ15N定值實驗組數(shù)為12組(表5)。

表5 各實驗室δ15N值的分析方法和分析數(shù)據(jù)Table 5 Multiple measurement data of δ15N for the four reference materials

3.5 數(shù)據(jù)處理

本次標準物質以組均值為基礎，整理各協(xié)作實驗室報出的數(shù)據(jù)，按標準物質數(shù)據(jù)處理的模式[27-32]：①分別采用狄克遜法(Dixon)和格拉布斯法(Grubbs)同時進行離群值檢驗，兩種方法檢驗均為離群值則予以剔除；②采用夏皮羅-威爾克法(Shapiro-Wilk)檢驗數(shù)據(jù)正態(tài)性；③采用科克倫法(Cochran)檢驗各組數(shù)據(jù)之間是否等精度。經檢驗研制的4個碳氮同位素標準物質正態(tài)檢驗值W均大于置信概率95%的列表值，剔除后的定值測試數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布。

3.6 不確定度計算與評估

《標準物質定值的通用原則及統(tǒng)計學原理》(JJF 1343—2012)明確了標準值的總不確定度由三部分組成。第一部分是標準物質定值過程帶來的不確定度uchar，包括：①定值數(shù)據(jù)平均值的不確定度uA，由定值實驗室間的標準偏差、測量次數(shù)及所要求的置信水平按統(tǒng)計方法計算得出；②對測量的其他一些影響因素作出分析估算出其大小uB。第二部分是物質的不均勻性引起的不確定性估計ubb；第三部分是物質在有效期內的變動性所引起的誤差uS；這三部分不確定度的合成不確定度為標準物質的總不確定度?，F(xiàn)簡要分析如下。

(1)分析測量的引起的A類不確定度和B類不確定度

本次標準物質是由多個實驗室使用一種準確可靠的方法協(xié)同進行定值。測量數(shù)據(jù)經正態(tài)分布檢驗分析得出各組數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布。因此以算術平均值作為最佳估計值(標準值)；A類不確定度為平均值的不確定度，以各實驗室定值數(shù)據(jù)平均值的標準偏差、測量次數(shù)及95%的置信水平算得，作為第一部分不確定度的估算值(包含了樣品分餾、測量全過程的誤差)。按照算術平均值的不確定度公式(1)進行計算：

(1)

式中：s—實驗室平均值數(shù)據(jù)間的標準偏差；n—實驗室平均值數(shù)據(jù)個數(shù)。

標準不確定度B類評定是通過借助可利用的相關信息，進行科學分析判斷而得到的標準偏差，經分析判斷得到的標準偏差，得出不確定度的B類判定分量。本次定值過程中樣品和國際標準物質均使用相同原理方法及儀器進行測量，樣品通過線性校正得到定值結果。本次B類不確度來源主要來自兩方面：由國際標準物質本身不確定度引入的不確定度和標準曲線擬合中數(shù)據(jù)對非線性的不確定度。

(2)不均勻性引起的不確定度

前已述及，通過均勻性檢驗證明4種標準物質均勻性良好，這里應用ISO35導則中數(shù)學統(tǒng)計方法進一步對不均勻性引起的不確定度進行分析。樣品組間不均勻性引起的標準偏差為MSamong，組內不均勻性引起的標準偏差為MSwithin，樣品不均勻性引起的不確定度(uhom)由公式(2)進行計算。

(2)

(3)不穩(wěn)定性引起的不確定度

4種標準物質的特征量值穩(wěn)定性數(shù)據(jù)中無可觀察到的趨勢。按照導則ISO35中8.5方法，選擇了通過斜率為零的回歸直線的不確定度估計穩(wěn)定性的不確定度ults，在給定的時間t內沒有顯著降解的情況下，采用公式(3)計算由于樣品不穩(wěn)定引起的不確定度：

ults=sb×t

(3)

(4)擴展不確定度

標準物質測量的擴展不確定度UCRM為定值測量不確定度uchar、均勻性引起的不確定度ubb、穩(wěn)定性引起的不確定度ults對特征值總不確定度的貢獻來計算，見公式(4)。當對應的置信水平為95%時，包含因子k=2，不確定度的修約是只進不舍。最終的定值結果列于表6。

表6 定值元素δ13C和δ15N認定值及擴展不確定度Table 6 δ13C and δ15N ceritified values for materials GBW04494 to GBW04497 and their associated expanded uncertainties (k=2)

(4)

4 結論

本文報道了獲批的有機質碳氮同位素國家一級標準物質(GBW04494～GBW04497)研制過程。本次研制的標準物質是基于研制單位多年實驗積累的數(shù)據(jù)和天然環(huán)境樣品中碳、氮同位素含量組成，參照國際已研制的穩(wěn)定碳氮同位素標準物質，研制完成的呈梯度分布、認定值區(qū)間范圍大的系列標準物質，其δ13C值為-45.60‰～2.16‰，δ15N值為-7.51‰～33.75‰，δ13C的定值擴展不確定度≤0.08‰，δ15N的定值擴展不確定度≤0.09‰，定值水平與國際標準物質相當。

該系列標準物質已供地質及環(huán)境部門分析監(jiān)控、儀器校準、方法評價、質量保證和質量監(jiān)控，為我國多家實驗室提供了測試溯源保障，為地質調查工作提供了技術支撐。同時該系列標準物質推動了同位素水文、環(huán)境學等相關學科研究工作的進展，也為本項目組后期進行其他穩(wěn)定同位素標準物質的研制積累了寶貴的經驗。