廖 妮， 楊 芳， 潘美辰， 劉 偉， 卓 穎*

(1. 西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 重慶 400715)

(2. 攀枝花學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院, 四川攀枝花 617000)

0 引言

分子機(jī)器在生物體中無處不在，執(zhí)行各種生理功能，包括機(jī)械驅(qū)動(dòng)、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。DNA 以其精確的堿基配對(duì)、序列可編程性、結(jié)構(gòu)可控性、易合成和修飾，被認(rèn)為是構(gòu)建人工分子機(jī)器理想的元件。 到目前為止，研究人員已經(jīng)設(shè)計(jì)出多種性能優(yōu)良的DNA 分子機(jī)器， 它可以在納米尺度上執(zhí)行特定的功能， 如：DNA 納米機(jī)器人[1-2]、DNA 鑷子[3-4]和DNA 步行器[5-6]等。 DNA步行器作為一種新型的人工納米機(jī)器，它是對(duì)自然產(chǎn)生的分子步行器（如動(dòng)力蛋白、肌球蛋白和驅(qū)動(dòng)蛋白）的人工模擬。 組成它的核酸能夠部分或全部地沿著精心設(shè)計(jì)的DNA 軌道自主地、漸進(jìn)地運(yùn)動(dòng)并整合運(yùn)動(dòng)過程中信號(hào)。該文將從DNA步行器的組成及其在生物傳感分析方面的應(yīng)用進(jìn)行概述。

1 DNA 納米步行器的構(gòu)建

從結(jié)構(gòu)上講，DNA 步行器由三個(gè)基本部件組成，包括行走鏈、軌道鏈和燃料分子或其他形式的驅(qū)動(dòng)行走的能量輸入（也稱為驅(qū)動(dòng)力）。 驅(qū)動(dòng)力打破初始平衡， 促進(jìn)光能或化學(xué)能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能，使行走鏈沿著軌道鏈運(yùn)動(dòng)。 然后，通過消耗燃料分子，恢復(fù)反應(yīng)平衡，從而產(chǎn)生信號(hào)。 平衡不斷地被打破和恢復(fù)，最后輸出放大的信號(hào)。 在驅(qū)動(dòng)力的刺激下，目標(biāo)物直接或者間接的參與導(dǎo)致反應(yīng)的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)平衡破壞而傾斜，然后其他的能量轉(zhuǎn)化為機(jī)械能， 這樣預(yù)先設(shè)計(jì)的DNA 鏈（行走鏈）就可以沿著軌道鏈行走。

1.1 行走鏈

根據(jù)DNA 步行器中行走鏈的數(shù)量，DNA 步行器可以分為 （1） 單足DNA 步行器、（2） 雙足DNA 步行器和（3）多足DNA 步行器。只有一條行走鏈可自由活動(dòng)的單足DNA 步行器是最簡(jiǎn)單的形式。 目前有兩種典型的單足DNA 步行器，分別如圖1 和圖2 所示。 圖1 中的單足DNA 步行器有一條長(zhǎng)長(zhǎng)的步行鏈， 其一端固定在剛性基質(zhì)（金納米顆粒）上，另一端由目標(biāo)物驅(qū)動(dòng)激活并沿著軌道鏈行走[7]。圖2 中的單足DNA 步行器的行走鏈?zhǔn)且粭l兩端可自由移動(dòng)的短鏈，該行走鏈由目標(biāo)物驅(qū)動(dòng)激活并在外切酶的輔助下，完成在軌道鏈上的行走[8]。

圖1 DNA 行走鏈和DNA 軌道鏈共同組裝在的單個(gè)AuNP 的三維DNA 納米機(jī)器Fig.1 Schematic illustrating the principle of the 3-D DNA nanomachine constructed by co-conjugating DNA walker and DNA track(substrate)components on a single AuNP.Copyright 2016 ACS

圖2 Exo Ⅲ驅(qū)使的DNA 步行器在球型核酸上的行走示意圖Fig.2 Schematics for Exo III-powered stochastic DNA walkers that move on the SNA surfaces.Copyright 2017 Wiley

單足DNA 步行器在實(shí)際應(yīng)用上存在一定的不足，步行鏈太短會(huì)導(dǎo)致行走速度較慢，行走空間范圍有限。 而行走鏈太長(zhǎng)，則行走軌跡難以控制并可能會(huì)脫離軌道，使得反應(yīng)暫時(shí)中止，只有等到行走鏈結(jié)合在另一條DNA 軌道上， 反應(yīng)才能繼續(xù)進(jìn)行， 從而導(dǎo)致行走過程中的步數(shù)減少，信號(hào)放大效率較低。

雙足DNA 步行器的行走鏈兩端相對(duì)自由，其行走鏈的兩端都可以沿著軌道鏈行走。 由于雙足DNA 步行器的行走鏈可以在軌道鏈上有更多作用位點(diǎn)， 與單足DNA 步行器相比， 雙足DNA步行器表現(xiàn)出更強(qiáng)的穩(wěn)定性和更高的反應(yīng)效率。如圖3 所示，Chai 等[9]設(shè)計(jì)了一種目標(biāo)物觸發(fā)的雙足DNA 步行器并應(yīng)用于目標(biāo)物的靈敏檢測(cè)。此外，Chen 等[10]采用核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)引發(fā)的一個(gè)無酶雙足DNA 步行器，構(gòu)建了一個(gè)靈敏、快速檢測(cè)microRNA 的電化學(xué)發(fā)光（ECL）生物傳感器。雖然雙足DNA 步行器的行走范圍比單足DNA 步行器寬，但是它們對(duì)運(yùn)動(dòng)軌跡的可控性相對(duì)較差。

圖3 基于雙足DNA 步行器的電化學(xué)基因傳感器的構(gòu)建示意圖Fig.3 Illustration of the bipedal DNA walker based electrochemical genosensor.Copyright 2019 ACS

當(dāng)DNA 步行器的行走鏈增加時(shí)， 可以增加與軌道鏈的作用位點(diǎn)，提高反應(yīng)速率。 因此，多足DNA 步行器的研究成為趨勢(shì)。 目前，已經(jīng)報(bào)道的多足DNA 步行器主要有三足型、 四足型以及球型等。 如圖4 所示，Li 等[11]設(shè)計(jì)了一種四足DNA步行器，它有4 條行走鏈，在目標(biāo)蛋白鏈霉親和素（SA）存在下，生物素修飾的行走鏈與固定在金屬上的發(fā)卡發(fā)生催化發(fā)卡自組裝-H1（MB-CHAH1）相互作用進(jìn)而打開發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 此外，Zhang等[12]將DNA 行走鏈和DNA 軌道鏈分別固定在金納米顆粒上，形成球型DNA 步行器。 在目標(biāo)物的作用下， 球型DNA 步行器的行走鏈被激活并與球型軌道鏈雜交，在酶的作用下，軌道鏈被切割，同時(shí)，相鄰的行走鏈可以與下一條軌道鏈結(jié)合（圖5）。該球型DNA 步行器以寨卡病毒核糖核酸片段為模型， 構(gòu)建的傳感器具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和回收率高的優(yōu)點(diǎn)。 多足DNA 步行器的行走鏈可以與軌道鏈協(xié)同結(jié)合，使得行走鏈穩(wěn)定不易脫軌，實(shí)現(xiàn)信號(hào)的多重累積。

圖4 基于等溫鏈置換聚合酶鏈反應(yīng)的DNA 步行器對(duì)親和素靈敏檢測(cè)的原理示意圖Fig.4 A schematic illustration of the principle for the sensitive detection of SA based on an ISDPR-DNA walker.Copyright 2018 ACS

圖5 目標(biāo)物引發(fā)的粒子間相對(duì)運(yùn)動(dòng)的DNA 步行器示意圖Fig.5 Schematic illustration of the interparticle relatively motional DNA walker triggered by the target.Copyright 2020 RCS

1.2 軌道鏈

DNA 步行器的設(shè)計(jì)要求軌道鏈與行走鏈牢固地結(jié)合，同時(shí)軌道鏈通常還擔(dān)任電化學(xué)或光學(xué)信號(hào)的輸出功能。 根據(jù)行走鏈的運(yùn)動(dòng)方式和運(yùn)動(dòng)范圍，軌道鏈的類型大致可分為一維直線、二維平面和三維球型核酸軌道。 Zhang 等[13]將二維平面軌道鏈介導(dǎo)的分子信標(biāo)在內(nèi)切酶的輔助下實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞因子干擾素-γ 的靈敏檢測(cè)（圖6）。干擾素-γ 可以與DNA 雙鏈上的適配子結(jié)合從而激活行走鏈，在內(nèi)切酶的輔助下，觸發(fā)軌道鏈離開電極表面打開分子信標(biāo)2 從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)。 由于三維球型核酸軌道擁有更多與行走鏈結(jié)合的位點(diǎn)，因而引起了研究者廣泛的興趣。 Luo等[14]將磁性分離技術(shù)和球型核酸軌道DNA 步行器擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建了一種靈敏的電化學(xué)生物傳感器實(shí)現(xiàn)了對(duì)人類免疫缺陷病毒脫氧核糖核酸的檢測(cè)。 如圖7 所示，通過將大量的軌道鏈固載在磁性納米顆粒上形成球型核酸軌道，一方面可以提高軌道鏈的固載量，提供大量可以和行走鏈結(jié)合的位點(diǎn)，提高反應(yīng)速率。 另一方面可以從復(fù)雜的樣品中特異地捕獲和分離目標(biāo)，大大提高檢測(cè)靈敏度。 與二維的軌道鏈相比，將所有的DNA 軌道鏈結(jié)合在一個(gè)球型的納米顆粒表面，可以提高DNA 軌道鏈的固載密度， 從而加快催化反應(yīng)的速度。但是軌道鏈固定是隨機(jī)的。因此，準(zhǔn)確定量的設(shè)計(jì)DNA 軌道鏈可以有效地提高DNA的行走效率。

圖6 DNA 步行器和內(nèi)切酶輔助信號(hào)放大的生物傳感器用于干擾素-γ 的快速靈敏檢測(cè)Fig.6 Schematic diagram showing the principle of DNA walker and nicking enzyme assisted signal amplification method based biosensor for simple and ultrasensitive detection of IFN-γ.Copyright 2018 Elsevier

圖7 DNA 步行器和磁性分離放大的電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建Fig.7 Illustration of the DNA walker and the magnetic separation-amplified single-particle electrochemical biosensor.Copyright 2021 ACS

1.3 驅(qū)動(dòng)力

通常DNA 步行器的行走需要外界的一些驅(qū)動(dòng)力，比如，酶，光照，化學(xué)反應(yīng)或者核酸單元等。當(dāng)目標(biāo)物存在時(shí)，初始平衡可以從熱力學(xué)或動(dòng)力學(xué)上向一個(gè)方向傾斜，反應(yīng)體系從高能級(jí)轉(zhuǎn)變?yōu)榈湍芗?jí)。 驅(qū)動(dòng)力的類型通常由目標(biāo)物質(zhì)的性質(zhì)決定。 DNA 步行器通常是由核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶和脫氧核酸酶等推動(dòng)DNA 行走鏈沿著軌道鏈行走。 由于酶參與的反應(yīng)對(duì)環(huán)境要求較高，因此，熵驅(qū)動(dòng)擴(kuò)增作為一種無酶參與的反應(yīng)在生物分析中顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。 如圖8 所示，Yang 等[15]報(bào)道了一種熵驅(qū)動(dòng)的DNA 步行器放大策略。 該生物傳感器的界面由三條鏈在金電極上自組裝而成，兩個(gè)不同功能的適配體與不同的目標(biāo)凝血酶的位點(diǎn)結(jié)合， 鄰位觸及引發(fā)固定在三鏈DNA復(fù)合物中的一個(gè)短鏈DNA 的鏈置換， 從而暴露出一個(gè)預(yù)先鎖定的結(jié)構(gòu)域， 與亞甲基藍(lán)標(biāo)記的DNA 鏈 （MB-DNA） 雜交。 隨后，MB-DNA 的toehold-介導(dǎo)的鏈置換導(dǎo)致適體/蛋白質(zhì)復(fù)合物的釋放和回收。 最終，大量的MB-DNA 鏈被傳感器的表面捕獲，對(duì)凝血酶產(chǎn)生顯著放大的電化學(xué)反應(yīng)。 熵驅(qū)動(dòng)擴(kuò)增具有簡(jiǎn)單、非機(jī)械化的特點(diǎn)，克服了有酶介導(dǎo)的反應(yīng)對(duì)環(huán)境要求高的缺點(diǎn)。

圖8 熵驅(qū)動(dòng)的DNA 步行器測(cè)定凝血酶的原理圖Fig.8 Schematic diagram of entropy-driven DNA walkers for thrombin determination.Copyright 2017 ACS

2 DNA 步行器在生物分析中的應(yīng)用

DNA 步行器以其快速的行走動(dòng)力學(xué)和靈敏的處理速度有利于在一定時(shí)間內(nèi)獲得較高的信號(hào)增益。 因此，DNA 步行器被認(rèn)為是一種理想的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和放大工具， 特別是與DNA 擴(kuò)增反應(yīng)包括催化發(fā)夾自組裝，鏈置換反應(yīng)，滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，酶反應(yīng)以及多種反應(yīng)策略相結(jié)合在生物分析中引起了廣泛的關(guān)注。 接下來主要從按照不同檢測(cè)對(duì)象，如DNA、microRNA、蛋白質(zhì)、霉菌毒素和細(xì)胞檢測(cè)等方面展開介紹。

2.1 DNA 步行器在DNA 檢測(cè)方面的應(yīng)用

DNA 步行器作為一種理想的信號(hào)傳導(dǎo)和放大工具，可適用于特定DNA 的檢測(cè)。 Tao 等[16]研制了一個(gè)基于DNA 步行器和目標(biāo)物引發(fā)的催化發(fā)夾自組裝的模塊化生物傳感平臺(tái)并用于乙型肝炎病毒（HBV）核酸的檢測(cè)，檢測(cè)范圍為0.5～50 nmol/L。 此外，Zheng 等[17]開發(fā)了一種將DNA 滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）反應(yīng)和DNA 步行器相結(jié)合的生物傳感器，并用于人類免疫缺陷病毒（HIV）核酸的檢測(cè)。 該生物傳感器具有較高的選擇性和靈敏性，能夠在實(shí)際樣品中檢測(cè)目標(biāo)DNA，在生物學(xué)研究和臨床應(yīng)用上表現(xiàn)出誘人的前景。 該方法在生物研究和臨床診斷中具有廣闊的應(yīng)用前景。 此外， 基于DNA 步行器的生物傳感器也被應(yīng)用于突變基因的檢測(cè)，如圖9 所示，Wu 等[18]構(gòu)建了DNA 步行器結(jié)合滾環(huán)級(jí)聯(lián)放大納米機(jī)器實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤相關(guān)基因p53 的超靈敏檢測(cè)，該生物傳感器在人血中p53 基因的準(zhǔn)確檢測(cè)中具有實(shí)用價(jià)值。DNA 步行器較早應(yīng)用于DNA 傳感方面，但對(duì)病毒和細(xì)菌等特異性DNA 的檢測(cè)還有待進(jìn)一步研究。

圖9 三維DNA 步行器與三維DNA 滾環(huán)機(jī)器結(jié)合的級(jí)聯(lián)擴(kuò)增策略示意圖Fig.9 Schematic illustration of the cascade amplification strategy of a 3D DNA walker coupled with a 3D DNA rolling machine.Copyright 2020 ACS

2.2 DNA 步行器在microRNA 分析中的應(yīng)用

MicroRNAs 作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子的非編碼短小RNA。 它們的核酸序列有很高的相似性，但在細(xì)胞中的表達(dá)水平很高， 這增加了檢測(cè)的難度。因此，提高microRNA 的檢測(cè)靈敏度具有重要意義。 已經(jīng)有許多文獻(xiàn)報(bào)道了基于DNA 步行器的生物傳感器，他們?cè)跈z測(cè)microRNAs 方面表現(xiàn)出了良好的選擇性、 靈敏度和重復(fù)性等優(yōu)異性能。 Liu 等[19]采用多環(huán)芳烴作為電化學(xué)發(fā)光體（DPA NBs），Pt-Ag 合金納米花為共反應(yīng)促進(jìn)劑結(jié)合單足DNA 步行器構(gòu)建了一個(gè)新型的ECL“off-on”開關(guān)的生物傳感器（圖10）。 鎖住的DNA行走鏈和修飾有猝滅探針的DNA 軌道鏈同時(shí)固定在電極界面上，使得初始的ECL 信號(hào)處于“信號(hào)關(guān)閉”狀態(tài)。 在目標(biāo)物microRNA 141（miRNA-141）和核酸外切酶T7 存在下，激活DNA 行走鏈與DNA 軌道鏈雜交， 猝滅探針離開電極界面恢復(fù)強(qiáng)烈的ECL 信號(hào)，使其處于“信號(hào)開啟”狀態(tài)。此基于DNA 步行器的生物傳感器對(duì)miRNA-141的檢測(cè)下限可達(dá)29.5 amol/L。 最近，我們采用了四-(4-氨基苯)乙烯（TAPE）調(diào)控的苝微晶作為新型ECL 發(fā)光材料， 結(jié)合行走鏈的位置可控的DNA 步行器實(shí)現(xiàn)了對(duì)microRNA let-7a 的靈敏檢測(cè)[20]。該工作中提出的位置可控的策略能夠增加反應(yīng)效率和提高DNA 步行器在行走中的動(dòng)力學(xué)，這為臨床生物分析中生物分子的靈敏檢測(cè)提供新的思路（圖11）。 與電化學(xué)發(fā)光傳感器相比，由于熒光傳感器可以實(shí)現(xiàn)均相檢測(cè)， 因此用于microRNA 檢測(cè)的熒光傳感器也迅速涌現(xiàn)。 Yang等[21]巧妙地設(shè)計(jì)了Janus 三維DNA 納米機(jī)器用于同時(shí)靈敏地檢測(cè)兩種不同的microRNA。 它可以有效地消除由于兩個(gè)不同的信號(hào)探針接近時(shí)導(dǎo)致的信號(hào)干擾， 提高了對(duì)microRNA 的檢測(cè)靈敏度。

圖10 基于一步法DNA 步行器放大的生物傳感器對(duì)miRNA-141 的檢測(cè)示意圖Fig.10 Ultrasensitive detection of miRNA-141 based on the one-step DNA walker amplification.Copyright 2018 ACS

圖11 位置可控的DNA 步行器的制備(A)及對(duì)microRNA let-7a 的檢測(cè)示意圖(B)Fig.11 Schematic illustration of the location-controllable DNA walker fabrication(A),the operating principle of the biosensor based on the location-controllable DNA walker for let-7a determination.Copyright 2021 ACS

2.3 DNA 步行器在蛋白質(zhì)分析中的應(yīng)用

快速、 靈敏地檢測(cè)與臨床相關(guān)的蛋白質(zhì)，如一些生物標(biāo)志物等，在疾病的早期診斷中起著至關(guān)重要的作用。 由于缺乏核酸擴(kuò)增類似的蛋白質(zhì)擴(kuò)增技術(shù)，低豐度蛋白質(zhì)的分析仍然面臨著巨大的挑戰(zhàn)。DNA 步行器在行走的過程中具有信號(hào)累積放大的優(yōu)勢(shì)，為實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的靈敏檢測(cè)提供了有效的途徑。 Chen 等[22]提出了基于蛋白質(zhì)結(jié)合誘導(dǎo)的鄰近識(shí)別和聚合酶驅(qū)動(dòng)的DNA 步行器策略，用于蛋白質(zhì)的靈敏檢測(cè)。 如圖12 所示，設(shè)計(jì)兩個(gè)DNA 探針分別固定在電極上和作為DNA行走鏈。 蛋白質(zhì)與這兩個(gè)探針上標(biāo)記的識(shí)別元件的結(jié)合帶來了它們的鄰近雜交， 在DNA 聚合酶存在下， 標(biāo)記有探針的Fc-P3 發(fā)生DNA 聚合，DNA 行走鏈釋放，繼而與相鄰的固定化探針上進(jìn)行雜交，再進(jìn)行聚合酶驅(qū)動(dòng)的DNA 步行器操作。實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白質(zhì)的靈敏識(shí)別和選擇性檢測(cè)，對(duì)地高辛抗體檢測(cè)限為80 pmol/L。 因此，該研究為基于DNA 步行器檢測(cè)蛋白質(zhì)提供了一種簡(jiǎn)單、通用和一步放大的的電化學(xué)發(fā)光方法。 核糖核酸酶H（RNase H）是一種細(xì)胞內(nèi)核糖核酸酶，在細(xì)胞過程中起著至關(guān)重要的作用，尤其與許多疾病過程有關(guān)。 Wang 等[23]提出了一種新的基于RNaseH驅(qū)動(dòng)的DNA 步行機(jī)的信號(hào)放大策略， 用于特異和靈敏的RNaseH 活性檢測(cè)。 該方法已成功地用于復(fù)雜環(huán)境中RNaseH 活性的檢測(cè)和相關(guān)抑制劑的篩選。 因此，RNaseH 驅(qū)動(dòng)的DNA 步行器為RNaseH 活性檢測(cè)提供了一個(gè)新的平臺(tái)。

圖12 基于DNA 步行器的生物傳感器對(duì)抗地高辛抗體檢測(cè)原理示意圖Fig.12 Schematic diagram of the DNA walkers based biosensor for anti-dig antibody.Copyright 2019 Elsevier

2.4 DNA 步行器在霉菌毒素分析中的應(yīng)用

霉菌毒素是真菌界生物產(chǎn)生的一種有毒次生代謝物。 它可以污染各種食物，導(dǎo)致食物急性中毒，嚴(yán)重的將導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。 將DNA 步行器引入到生物傳感器的構(gòu)建中，適合于真菌毒素的快速、靈敏分析。 通常霉菌毒素的檢測(cè)是利用相應(yīng)的適體作為分子識(shí)別元件，可以將霉菌毒素分析轉(zhuǎn)化為相應(yīng)核酸檢測(cè)。赭曲霉毒素A 是毒性最大、分布最廣、產(chǎn)毒量最高、對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的污染最重、與人類健康關(guān)系最為密切，是繼黃曲霉毒素后又一個(gè)引起世界廣泛關(guān)注的霉菌毒素。如圖13所示，Zhong 等[24]設(shè)計(jì)了多位點(diǎn)錨定的DNA 步行器應(yīng)用于赭曲霉毒素A 的檢測(cè)。在目標(biāo)物的存在下可以完成轉(zhuǎn)換形成球型DNA 步行器。 多位點(diǎn)錨定的DNA 步行器可以實(shí)現(xiàn)高的局部濃度，提高了反應(yīng)速率，為赭曲霉毒素A 的檢測(cè)提供了新的方向。 此外，Zhou 等[25]設(shè)計(jì)了一種基于滾環(huán)擴(kuò)增輔助放大的多足DNA 步行器， 用于銅綠假單胞菌的檢測(cè)。 基于DNA 步行器構(gòu)建的傳感器可以實(shí)現(xiàn)對(duì)霉菌毒素的靈敏檢測(cè)， 在食品安全、環(huán)境檢測(cè)和疾病診斷等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖13 DNA 步行器對(duì)赭曲霉毒素A 的檢測(cè)示意圖Fig.13 Schematic illustration of the OTA-induced multisite-anchored DNA nanomachines based biosensor.Copyright 2021 ACS

2.5 DNA 步行器在細(xì)胞分析中的應(yīng)用

DNA 步行器除了用于DNA、microRNAs、蛋白質(zhì)和真菌毒素的檢測(cè)外，具有強(qiáng)大富集信號(hào)能力的DNA 步行器同樣適用于細(xì)胞分析。 Miao等[26]提出了一種基于金納米粒子的多足DNA 步行器用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)。 淀粉樣多肽寡聚物（AβO）被廣泛認(rèn)為是診斷阿爾茨海默病的最有前途的生物標(biāo)志物。 Yin 等[27]設(shè)計(jì)了一種三維DNA 步行器，用于在癌細(xì)胞中AβO 的檢測(cè)。該策略具有靈敏度高、特異性高、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，為阿爾茨海默病的早期診斷提供了廣闊的前景。 此外，Peng 等[28]報(bào)道了將整個(gè)DNA 步行器構(gòu)建在一個(gè)20 nm 的金納米顆粒（AuNP）上，上面修飾有數(shù)百條底物鏈作為軌道鏈，以及幾十個(gè)被鎖住保持沉默的DNA 酶分子（圖14）。該DNA 步行器與細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)物相互作用， 激活了DNA 酶分子開始在AuNP 上的自主行走。 基于DNA 步行器的信號(hào)放大原理能夠檢測(cè)單個(gè)癌細(xì)胞中特定的microRNAs。 DNA 步行器為癌細(xì)胞的檢測(cè)提供了強(qiáng)有力的工具。 但是進(jìn)一步擴(kuò)大DNA 步行器對(duì)臨床樣本的檢測(cè)仍然有許多問題需要解決，如DNA 步行器對(duì)復(fù)雜樣品的高選擇性，高濃度的細(xì)胞或血清蛋白可能會(huì)阻礙DNA 步行器的行走等。

圖14 DNA 步行器對(duì)活細(xì)胞中特定microRNAs 的檢測(cè)示意圖Fig.14 Schematic diagram of the DNA walkers for the detection of the specific miRNA.Copyright 2017 Springer Nature

3 總結(jié)

DNA 步行器具有結(jié)構(gòu)可控及整合行走過程中的信號(hào)等優(yōu)點(diǎn)，在生命分析領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。但是，DNA 步行器未來還有很多地方需要改進(jìn)。比如，DNA 步行器檢測(cè)目標(biāo)單一， 難以適用于復(fù)雜生物環(huán)境分析。 此外，生物體內(nèi)各種核酸酶也會(huì)對(duì)DNA 步行器的檢測(cè)造成干擾?？傊珼NA 步行器的研究雖然取得了較大的進(jìn)展，但是要克服上述難題還需要科研工作者們不懈的努力。