史麗 馬靜 趙喜娃 關(guān)英霞 孫亞平 趙連梅 單保恩

子宮內(nèi)膜癌在女性生殖道惡性腫瘤中所占比例高達(dá)20%～30%，通常早期子宮內(nèi)膜癌臨床預(yù)后較好，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，無論何種病理類型及分期均會導(dǎo)致較差的預(yù)后[1]。近年來，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢[2],因此，探索有效的腫瘤標(biāo)志物對子宮內(nèi)膜癌早期診斷及制定治療方案有重要的意義。B細(xì)胞異位基因2(B-cell translocation gene 2，BTG2)是 BTG/TOB 蛋白家族中的六位成員之一[3]，該家族成員能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化及凋亡[3,4]。一項(xiàng)研究結(jié)果顯示，在惡性腫瘤中BTG2存在表達(dá)失調(diào)，在一系列惡性腫瘤中具有抑癌作用，BTG2 是一個(gè)瞬時(shí)早期反應(yīng)基因，有參與基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、細(xì)胞周期及凋亡以及綜合性應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)行為，可以用作各種癌癥的預(yù)后生物標(biāo)志物[5]。但是,BTG2在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)、作用的關(guān)系以及能否作為預(yù)后指標(biāo)還不清楚。因此，本研究采用qRT-PCR、Western-blot以及免疫組化方法檢測BTG2在子宮內(nèi)膜癌組織中的基因及蛋白水平表達(dá)情況，并分析其表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1～12月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦科行手術(shù)治療的子宮內(nèi)膜癌患者40例，年齡(55±8)歲，選取癌組織和癌旁組織分為癌組和癌旁組。癌旁取材標(biāo)準(zhǔn)為距離腫瘤邊緣3 cm，并經(jīng)病理證實(shí)為非癌組織，將所取新鮮組織立即在液氮中冷凍，并儲存在-80℃。另選取2016年1月至2017年12月子宮內(nèi)膜癌患者(試驗(yàn)組)內(nèi)膜癌組織標(biāo)本98例，年齡(54±9)歲，根據(jù) 2009 年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期(FIGO2009)，Ⅰ、Ⅱ期 58例，Ⅲ、Ⅳ期 40例；組織病理類型為子宮內(nèi)膜樣腺癌 76 例，非子宮內(nèi)膜樣腺癌22例(漿液性腺癌16例、透明細(xì)胞癌4例、未分化癌2例)。 選擇同期因良性病變行子宮切除或內(nèi)膜切除且病理檢查證實(shí)子宮內(nèi)膜良性病變的組織標(biāo)本 80例(對照組)，年齡(52±10)歲,2組患者一般資料有可比性(P>0.05)。所有子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)前未接受放療、化療和激素治療，患者及其家屬均簽署了知情同意書，該研究獲得了河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院的倫理學(xué)批準(zhǔn)。

1.2 材料與試劑 Trizol試劑和PCR引物購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和BCA 蛋白定量檢測試劑盒購自美國 Thermo公司，GAPDH 抗體購自美國 Proteintech公司。

1.3 熒光實(shí)時(shí)定量 PCR(Real-Time Quantitative PCR，RT-PCR)檢測組織中mBTG2的相對表達(dá)水平。 用 TRIzol 試劑提取組織中總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測其濃度。 按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在20 μl體系中加 3 μg總RNA 進(jìn)行 cDNA 合成。 根據(jù)RT-PCR 試劑盒說明書,以合成的 cDNA 為模版，加入反應(yīng)試劑，進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，以GAPDH基因作為內(nèi)參照。Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)BTG2引物，BTG2上游為 5’-CATCATCAGCAGGGTGGC-3’，下游為 5’-CCCAATGCGGTAGGACAC-3’，擴(kuò)增片段大小為122 bp;GAPDH內(nèi)參的上游引物為5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’,下游引物5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’，擴(kuò)增片段大小為119 bp。根據(jù)實(shí)驗(yàn)所獲Ct值對BTG2進(jìn)行相對定量，用比較Ct值法(2-ΔCt)進(jìn)行分析(ΔCt=CT BTG2-CT GAPDH)。

1.4 Western-blot方法檢測組織中BTG2的蛋白表達(dá)水平 將癌組組和癌旁組各組織應(yīng)用RIPA 裂解液提取各組組織中的總蛋白質(zhì)。BCA 法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。具體步驟為：配制SDS-PAGE的凝膠，將蛋白變性后的上清，分別加入濃縮膠的上樣孔中；取4 μl蛋白marker加于上樣孔。4℃條件下，恒壓90 V，電泳緩沖液中泳動3 h，根據(jù)蛋白分子量不同進(jìn)行分離。根據(jù)目的蛋白大小將分離的蛋白區(qū)帶凝膠切下，置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡，PVDF膜先在甲醇中浸泡3 min，再放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5 min。將PVDF膜平鋪在凝膠上，PVDF膜和凝膠兩側(cè)各放三層濾紙，凝膠在負(fù)極，PVDF膜在正極，放入電轉(zhuǎn)儀中，4℃條件下進(jìn)行印記電泳(300 mA，1.5 h)。 取出PVDF膜，用5%脫脂奶粉37℃封閉1 h。TBST洗膜10 min×3次，加入TBST稀釋的相應(yīng)的一抗，4℃孵育過夜。TBST洗膜10 min×3次，加入TBST稀釋的紅外熒光標(biāo)記的二抗，37℃反應(yīng)1 h，注意避光。 TBST洗膜10 min×3次(避光)，用Odyssey雙色紅外熒光掃描系統(tǒng)進(jìn)行成像并分析。

1.5 應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法 脫蠟：石蠟切片標(biāo)記后，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水震蕩沖洗。封酶并抗原修復(fù)，稀釋BTG2抗體：用PBS將一抗稀釋至所需的濃度(1∶50)；血清封閉并滴加一抗過夜，次日取出放入37℃恒溫箱中孵育50 min，取出組織切片用PBS清洗3次(震蕩)，每次5 min；滴加二抗(pv6001)：在每個(gè)組織塊上加入50 μl左右的二抗并DAB顯色并蘇木素復(fù)染，脫水封片并顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。將實(shí)驗(yàn)結(jié)果分為低表達(dá)組:弱表達(dá)(+)和中表達(dá)(++)；高表達(dá)組，強(qiáng)表達(dá)(+++)。

2 結(jié)果

2.1 癌組及癌旁組BTG2的mRNA的相對表達(dá)水平 應(yīng)用RT-PCR方法檢測2組BTG2的mRNA的相對表達(dá)水平，癌組及癌旁組分別為(0.24±0.13)、(0.51±0.22)，子宮內(nèi)膜癌組BTG2的相對表達(dá)量明顯低于癌旁組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 癌組及癌旁組BTG2蛋白的相對表達(dá)水平 應(yīng)用Western-blot方法檢測2組BTG2蛋白表達(dá)水平，癌組和癌旁組的相對表達(dá)水平分別為(0.99±0.08)、(2.16±0.12)，癌組BTG2 蛋白相對表達(dá)量明顯低于癌旁組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

圖1 癌組及癌旁組BTG2蛋白的相對表達(dá)水平

2.3 子宮內(nèi)膜癌和內(nèi)膜良性病變組織中 BTG2的蛋白表達(dá)水平 應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測BTG2在子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)情況顯示BTG2在子宮內(nèi)膜細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)。試驗(yàn)組：低表達(dá)78例(79.6%)，高表達(dá)20例(20.4%)；對照組：低表達(dá)24例(30.0%)，高表達(dá)56例(70.0%)，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果表明在子宮內(nèi)膜癌組織中BTG2的蛋白表達(dá)水平明顯低于子宮內(nèi)膜良性病變組織。見圖2，表1。

子宮內(nèi)膜良性病變組織子宮內(nèi)膜癌組織

表1 不同子宮內(nèi)膜病變組織中BTG2蛋白表達(dá) 例(%)

2.4 子宮內(nèi)膜癌組織中 BTG2 的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 BTG2 表達(dá)水平與臨床分期、組織分級、淋巴血管浸潤、淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)：臨床期別越高，BTG2的表達(dá)水平越低；病理分級越高BTG2的表達(dá)水平越低；存在血管、淋巴管浸潤的BTG2的表達(dá)水平降低；存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的BTG2的表達(dá)水平降低；BTG2 表達(dá)水平與年齡、肌層浸潤深度、組織類型無關(guān)。見表2。

表2 子宮內(nèi)膜癌組織中BTG2蛋白表達(dá)與不同臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。近年來對于子宮內(nèi)膜癌的病因?qū)W研究屢見報(bào)道，如PTEN基因突變和丟失、DNA錯(cuò)配導(dǎo)致的微衛(wèi)星不穩(wěn)定等[6,7]；除了針對基因的研究，調(diào)節(jié)基因的變化和多位點(diǎn)調(diào)節(jié)也是目前研究的熱點(diǎn)，如長鏈非編碼基因、microRNA等[8]。BTG2 是于 1996 年 被 Rouault 等[9]發(fā)現(xiàn)，其基因位于1q32，僅由兩個(gè)外顯子組成。BTG2在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，可以在人體腎臟，肺，前列腺，胰腺，胸腺等器官中檢測到BTG2[10]。有研究表明，BTG2 是一個(gè)瞬時(shí)早期反應(yīng)基因，有參與基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、細(xì)胞周期及凋亡以及綜合性應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)行為[11,12]。有研究顯示，BTG2是腫瘤抑制基因，BTG2的mRNA表達(dá)受microRNAs.調(diào)控，比如在BTG2的mRNA的3’非翻譯區(qū)發(fā)現(xiàn)多達(dá)17個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)參與BTG2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[13]。BTG2在乳腺癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌[14-17]等多個(gè)器官的實(shí)體瘤中均呈現(xiàn)低表達(dá)。本研究通過應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)BTG2在子宮內(nèi)膜組織中的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，癌組織中表達(dá)水平較子宮內(nèi)膜良性病變組織明顯減少，應(yīng)用RT-PCR、Western-blot相對定量檢測同樣發(fā)現(xiàn)了BTG2在子宮內(nèi)膜癌組織中的基因以及蛋白表達(dá)水平均低于癌旁或子宮內(nèi)膜良性病變組織，BTG2在內(nèi)膜癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，提示了BTG2可能參與了抑制子宮內(nèi)膜癌疾病進(jìn)展的過程。

多項(xiàng)既往研究結(jié)果顯示，BTG2通過相應(yīng)的分子機(jī)制在實(shí)體腫瘤組織中呈現(xiàn)出低表達(dá)水平，并且BTG2低表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)[18]。如在前列腺癌中，BTG2是miR-32，miR-21的靶標(biāo)，通過后者的抑制作用導(dǎo)致BTG2低表達(dá)，低水平BTG2會導(dǎo)致疾病的發(fā)生、發(fā)展、治療耐藥性和轉(zhuǎn)移等[15]；在乳腺癌中，通過細(xì)胞周期蛋白D1高表達(dá)/AKT磷酸化升高從而下調(diào)BTG2，并且低水平的BTG2與腫瘤等級、疾病進(jìn)展和低總生存率相關(guān)[16]；肝癌中，通過細(xì)胞周期蛋白D1 /細(xì)胞周期蛋白E的升高下調(diào)BTG2水平，并且低表達(dá)的BTG2水平導(dǎo)致腫瘤等級增加并與臨床病理的分化程度、是否肝硬化、癌栓、轉(zhuǎn)移情況及總生存期具有明顯相關(guān)性[17]。既往研究發(fā)現(xiàn)microRNA參與調(diào)控了子宮內(nèi)膜癌中癌基因或抑癌基因的表達(dá)并在疾病發(fā)展及治療中發(fā)揮一定的作用[19-21]，本課題組在既往研究中發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)miR-25-3p有可能參與調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌組織中BTG2的表達(dá)[22]。本研究結(jié)果表明BTG2呈現(xiàn)低表達(dá)并與子宮內(nèi)膜癌臨床病理之間的存在一定的相關(guān)性，其中病例組中FIGOⅠ、Ⅱ期 和Ⅲ、Ⅳ期 相比BTG2表達(dá)具有差異性，臨床期別越高BTG2的表達(dá)水平越低；病理分級越高BTG2的表達(dá)水平越低；存在血管、淋巴管浸潤的BTG2的表達(dá)水平降低；存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的BTG2的表達(dá)水平降低，上述結(jié)果均表明BTG2的低表達(dá)可能與子宮內(nèi)膜癌的的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有可能成為內(nèi)膜癌疾病基因靶向治療的節(jié)點(diǎn)。

綜上所述，BTG2在子宮內(nèi)膜癌組織異常低表達(dá)并臨床病理分期、分級、淋巴管血管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。我們推測BTG2可能抑制了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展，有望成為子宮內(nèi)膜癌的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)及病情監(jiān)測指標(biāo)，這與其它相關(guān)研究結(jié)果一致。但是,BTG2在子宮內(nèi)膜癌發(fā)病中的具體作用機(jī)制尚未明確，這點(diǎn)將是我們課題組下一步研究的重點(diǎn)。