熊明朋，龔瑋，劉波，鄭洋濱，劉寧

江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，南昌 330029

整腸丸主要有丁香、肉桂、陳皮、甘草、薄荷腦等組成，用于消化不良、水土不服和食物不潔所致腸胃不適，腹脹肚痛，惡心嘔吐等，具有保護(hù)胃黏膜和調(diào)節(jié)腸道菌群功能的作用［1］。為了預(yù)測(cè)其可能對(duì)人體產(chǎn)生的不良反應(yīng)，降低臨床受試者和藥品使用人群的用藥風(fēng)險(xiǎn)，需在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行長(zhǎng)期毒性研究。長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)是研究動(dòng)物連續(xù)給予受試物后，觀察受試物對(duì)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，可預(yù)測(cè)受試物可能引起的臨床不良反應(yīng)，判斷反復(fù)給藥后的毒性靶器官和靶組織，推測(cè)臨床試驗(yàn)的安全劑量以及提示臨床試驗(yàn)中需重點(diǎn)監(jiān)測(cè)的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)以人體推薦量的60 倍、30 倍、15 倍整腸丸對(duì)SD 大鼠進(jìn)行3 個(gè)月喂養(yǎng)試驗(yàn)，評(píng)價(jià)其安全性。

1 材料與方法

1.1 試藥整腸丸（香港李萬(wàn)山藥廠有限公司，批號(hào)：903013）；生化試劑盒（江西特康科技有限公司）。

1.2 儀器7020 自動(dòng)生化儀（株式會(huì)社日立制作所）；五分類全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（江西特康科技有限公司）；EG1150H 石蠟包埋機(jī)［徠卡顯微系統(tǒng)（上海）有限公司］；HM355S 全自動(dòng)石蠟切片機(jī)（MICROM 國(guó)際股份有限公司）；H11220 烘片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；全自動(dòng)封片機(jī)（賽默飛世爾科技公司）；BX63 雙人共覽熒光顯微鏡［奧林巴斯（中國(guó)）有限公司］。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及環(huán)境SPF 級(jí)SD 大鼠120 只，雌雄各半，體重80～100 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002，飼養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)室屏障環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（贛）2019-0001，動(dòng)物自由攝食和飲水。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法設(shè)低、中、高劑量分別為0.99、1.98、3.96 g/kg·bw；陰性對(duì)照組給予相同體積純化水，每組雌雄各15 只，按0.1 mL/kg·bw 經(jīng)口灌胃，每日一次，每周6 天。連續(xù)給藥3 個(gè)月，并停藥2 周作恢復(fù)性觀察。

實(shí)驗(yàn)期間，每天觀察并記錄動(dòng)物的一般表現(xiàn)、中毒體征和死亡情況，每周稱一次體重，按體重調(diào)整灌胃體積，計(jì)算動(dòng)物體重增長(zhǎng)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束（3個(gè)月給藥期結(jié)束時(shí)，各組取20 只大鼠）及停藥后2周（恢復(fù)期，各組取剩余10 只大鼠）分別取血測(cè)定血紅蛋白、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度、中性細(xì)胞、血小板比容、平均血小板體積等血液學(xué)指標(biāo)；取血清測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、肌酐、血糖、甘油三酯、總膽固醇、總蛋白和血清白蛋白、堿性磷酸酶等生化指標(biāo)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束（3 個(gè)月給藥期結(jié)束時(shí)，各組取20 只大鼠）及停藥后2 周（恢復(fù)期，各組取剩余10 只大鼠）分別處死動(dòng)物，解剖，觀察大體變化并稱重（心臟、胸腺、腎上腺、肝、腎、脾、子宮、腦、肺、卵巢、附睪、睪丸），計(jì)算臟/體比值。取心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、甲狀腺、主動(dòng)脈、胰腺、胸腺、大腦、小腦、脊髓、腎上腺、膀胱、坐骨神經(jīng)、睪丸、前列腺、附睪、氣管、食管、卵巢、子宮等臟器固定保存，對(duì)各劑量組的上述臟器進(jìn)行組織病理檢查，按組織固定、脫水、浸蠟、包埋、切片、烘片、染色和封片順序制作病理切片［2-5］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Excel 2007 軟件，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 13.0 進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以的形式表示。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 對(duì)一般狀態(tài)的影響試驗(yàn)期間各組大鼠生長(zhǎng)良好，活動(dòng)、進(jìn)食飲水及大小便情況正常。

2.2 對(duì)體重的影響在給予0.99、1.98、3.96 g/kg·bw劑量的整腸丸3 個(gè)月及停藥2 周后，各劑量組大鼠體重增長(zhǎng)趨勢(shì)與陰性對(duì)照組基本一致，與陰性對(duì)照組比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 對(duì)血液學(xué)指標(biāo)的影響整腸丸對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響見表1 和表2，試驗(yàn)結(jié)束期雄性低劑量組的紅細(xì)胞分布寬度（RDW）與陰性對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05），其它指標(biāo)均無(wú)顯著性差異；停藥兩周后均能恢復(fù)，所測(cè)血液指標(biāo)均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 對(duì)血生化指標(biāo)的影響整腸丸對(duì)大鼠血生化指標(biāo)的影響見表3 和表4。試驗(yàn)結(jié)束期，雄性低劑量大鼠的谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和尿素（BUN）與陰性對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05）；雌性低劑量大鼠的谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）與陰性對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05）；雌性中劑量大鼠的肌酐（CRE）與陰性對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05）；雌性中劑量大鼠的甘油三酯（TG）與陰性對(duì)照組比較有極顯著性差異（P＜0.01）；雄性高劑量組白蛋白（ALB）與陰性對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05）；其余指標(biāo)均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表1 試驗(yàn)結(jié)束整腸丸對(duì)大鼠血常規(guī)的影響（，n=10）

表1 試驗(yàn)結(jié)束整腸丸對(duì)大鼠血常規(guī)的影響（，n=10）

注：1.與陰性對(duì)照組比較，*:P<0.05。2.WBC：白細(xì)胞計(jì)數(shù)；RBC：紅細(xì)胞計(jì)數(shù)；HGB：血紅蛋白；PLT：血小板；LYM：淋巴細(xì)胞；NEU：中性細(xì)胞；HCT：紅細(xì)胞比容；MCHC：紅細(xì)胞平均血紅蛋白溶度；RDW：紅細(xì)胞分布寬度；MPV：平均血小板體積；PCT：血小板比容；下同。

表2 試驗(yàn)恢復(fù)期整腸丸對(duì)大鼠血常規(guī)的影響（，n=5）

表2 試驗(yàn)恢復(fù)期整腸丸對(duì)大鼠血常規(guī)的影響（，n=5）

表3 試驗(yàn)結(jié)束整腸丸對(duì)大鼠血生化的影響（，n=10）

表3 試驗(yàn)結(jié)束整腸丸對(duì)大鼠血生化的影響（，n=10）

注：1.與陰性對(duì)照組比較，*:P<0.05 ；與陰性對(duì)照組比較，**:P<0.01；2.CRE：肌酐；AST：谷草轉(zhuǎn)氨酶；ALT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶；TP：總蛋白；ALB：血清白蛋白；GLU：血糖；BUN：尿素氮；ALP：堿性磷酸酶；TC：總膽固醇；TG：甘油三酯；下同。

表4 試驗(yàn)恢復(fù)期整腸丸對(duì)大鼠血生化的影響（，n=5）

表4 試驗(yàn)恢復(fù)期整腸丸對(duì)大鼠血生化的影響（，n=5）

試驗(yàn)恢復(fù)期，各劑量組大鼠生化指標(biāo)與陰性對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.5 對(duì)臟器重量和臟器/體重比值的影響整個(gè)試驗(yàn)期間各劑量組大鼠心臟、胸腺、腎上腺、肝、腎、脾、子宮、睪丸、腦、肺、卵巢、附睪臟器重量和臟體比與陰性對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.6 對(duì)大體觀察及組織學(xué)檢查對(duì)全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行大體肉眼解剖檢查，試驗(yàn)結(jié)束期中、高劑量組各1 只動(dòng)物出現(xiàn)子宮積液；其余動(dòng)物大體形態(tài)正常，各器官均未見異常。停藥2 周恢復(fù)期各組動(dòng)物器官均未見明顯異常。

試驗(yàn)結(jié)束及恢復(fù)期分別取各組的肝、腎、脾、胃腸、子宮和卵巢等器官進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，均未見異常，組織結(jié)構(gòu)均正常。

3 討論

整腸丸的臨床人體推薦劑量為0.066 g/kg·bw，參照擬用臨床劑量法［3］，本實(shí)驗(yàn)選用臨床劑量的15、30 和60 倍設(shè)定低、中、高劑量組，即0.99、1.98、3.96 g/kg·bw。為了維持藥物濃度在大鼠體內(nèi)有較穩(wěn)定的水平，采用連續(xù)給藥方式［4］，連續(xù)三個(gè)月每周給藥6 天，保持藥物在機(jī)體內(nèi)的生物學(xué)效應(yīng)。

對(duì)大鼠進(jìn)行大體肉眼解剖檢查，結(jié)束期偶見3只雌性大鼠出現(xiàn)子宮積液，但對(duì)其病理組織學(xué)檢查，均未見異常，可能原因是生理性子宮積液，多見于月經(jīng)期，是非病理性的。

血液生理生化指標(biāo)值不僅受個(gè)體遺傳物質(zhì)控制［6］，還受年齡、性別、環(huán)境營(yíng)養(yǎng)等因素影響，若其中一個(gè)因素發(fā)生改變，都可能引起最終測(cè)定值的變化。在本實(shí)驗(yàn)中，有少量的血常規(guī)指標(biāo)如血紅蛋白和血生化指標(biāo)如谷草轉(zhuǎn)氨酶與陰性對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05），但這些指標(biāo)差異無(wú)劑量依賴趨勢(shì)［7-10］，且病理學(xué)未檢出與藥物毒性相關(guān)的病理變化，表明這些指標(biāo)差異可能非該藥的毒性所致，這與停藥2 周后各項(xiàng)指標(biāo)恢復(fù)正常相一致。然而血液生理生化值是判定藥物對(duì)靶器官和靶組織毒性的重要指標(biāo)［3］，提示在后續(xù)的臨床試驗(yàn)中需重點(diǎn)監(jiān)測(cè)血液生理生化指標(biāo)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明以整腸丸人體推薦量的60 倍、30 倍、15 倍對(duì)SD 大鼠進(jìn)行3 個(gè)月喂養(yǎng)試驗(yàn)，大鼠少數(shù)血液生理生化指標(biāo)有一定的改變，但停藥2 周后可以恢復(fù)，在今后的臨床應(yīng)用過程中仍值得繼續(xù)關(guān)注。