趙鵬，楊明

江西濟(jì)民可信集團(tuán)有限公司，南昌 330096

發(fā)酵蟲草菌粉（Cs-4）系從新鮮冬蟲夏草中分離所得的蟲草菌-蝙蝠蛾擬青霉（Cs-4）經(jīng)深層發(fā)酵培養(yǎng)，將發(fā)酵產(chǎn)物過濾，干燥制成。發(fā)酵蟲草菌粉（Cs-4）中含有腺苷、麥角甾醇、甘露醇、氨基酸等多種生物活性物質(zhì)。其中，甘露醇在臨床應(yīng)用上是良好的利尿劑，具有降低顱內(nèi)壓、眼內(nèi)壓等功效。同時(shí)，甘露醇也可用作糖尿病患者用食品、健美食品等低熱值、低糖的甜味劑。

目前，甘露醇的測定方法較多，常用的方法有高碘酸鹽氧化法、旋光法、折光法、比重法、分光光度法、高效液相色譜法等［1-3］。其中高碘酸鹽氧化法屬于化學(xué)方法，適用較高純度的甘露醇樣品，對于復(fù)雜體系來說，檢測會產(chǎn)生較大偏差。而旋光法屬于物理方法，雖然方法較為簡單，但更適合較高純度的甘露醇樣品。對于發(fā)酵蟲草菌粉（Cs-4）復(fù)雜體系中甘露醇的檢測，本文采用高效液相色譜-示差折光檢測器法（HPLC-RID）［4,5］測定發(fā)酵蟲草菌粉（Cs-4）中甘露醇的含量，以期為發(fā)酵蟲草菌粉（Cs-4）的全面質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器高效液相色譜儀（島津LC-20AD）、RID-20A 示差折光檢測器（日本島津公司）；電子天平（賽多利斯 BT25S）；恒溫水浴鍋（HH 系列XMTD-204）；超聲波清洗儀（舒美 KQ-500E）。

1.2 試藥甘露醇對照品（中國食品藥品檢定研究院；批號：100533- 201304；含量：99.0%）；乙腈為色譜純；無水乙醇為分析純。發(fā)酵蟲草菌粉（Cs-4）（生產(chǎn)企業(yè)：江西國藥有限責(zé)任公司；批號：18020076、18020077、18020078、18020081、18020083、18020098、18020109、18030140、18030146、18030175、18040181、18040182、18 040183；批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z10890021）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備取甘露醇對照品適量，精密稱定，加流動相溶解制成每1 mL 約含2 mg 的對照品溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備取供試品約1 g，精密稱定，精密加入水25 mL，稱定重量，50 ℃超聲處理60 min，放冷，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，離心，取續(xù)濾液10 mL 至蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘?jiān)昧鲃酉嗳芙獠⒍ㄈ葜?0 mL 量瓶中，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件采用Carbomix Ca-NP 5∶8%色譜柱（7.8 mm × 300 mm，5 μm），以乙腈-水（10:90）為流動相；流速為0.5 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；柱溫為80 ℃；示差折光檢測器溫度為55 ℃。在上述色譜條件，對照品及樣品的色譜圖見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察取甘露醇對照品適量，精密稱取，加流動相溶解制成每1 mL 約含甘露醇4 mg 的對照品貯備液。精密量取對照品儲備液0.25、0.5、2.5、5.0、10.0 mL 分別用流動相稀釋定容至10 mL量瓶中，得甘露醇質(zhì)量濃度分別為0.099、0.198、0.989、1.978、3.955 mg/mL。分別精密吸取上述對照品溶液各20 μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定峰面積，以對照品質(zhì)量濃度X（mg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算?？傻酶事洞蓟貧w方程為：Y=3.233×105X+1.276×103（r=0.999 7）。結(jié)果表明，甘露醇質(zhì)量濃度在0.099～3.955 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別于制備后0、2、4、8、16、24 h 進(jìn)樣，測定甘露醇的峰面積。結(jié)果，甘露醇的峰面積RSD為0.76%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 精密度試驗(yàn)取供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定峰面積。結(jié)果，甘露醇的峰面積RSD 為0.62%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)取供試品（批號：18040182）1 g，按“2.2”項(xiàng)下的方法平行制備6 份供試品溶液，測定供試品中甘露醇的含量。結(jié)果，甘露醇含量的平均值為4.292%，RSD 為1.80%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)精密稱取已知含量的樣品（批號：18040182）約0.5 g，共6 份，精密稱定，分別加入相當(dāng)于供試品含量的對照品，按“2.2”項(xiàng)下的方法處理，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分析，記錄色譜圖，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。結(jié)果，甘露醇的平均回收率為96.0%，RSD 為1.67%。表明該方法回收率良好。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測定取供試品13 批，按“2.2”項(xiàng)下的方法平行制備供試品溶液，每批次樣品平行處理兩份，每份進(jìn)樣兩針，以平均面積計(jì)算甘露醇含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果 %

（續(xù)表）

3 討論

在方法研究過程中，本實(shí)驗(yàn)通過改變分析方法描述中的色譜條件參數(shù)，驗(yàn)證耐用性。通過對柱溫條件進(jìn)行篩選，于78 ℃、80 ℃、82 ℃柱溫進(jìn)行試驗(yàn)，分別計(jì)算甘露醇峰面積RSD%。RSD%分別為0.73%、0.57%、0.16%。結(jié)果顯示，柱溫變動符合系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求。通過對流速條件進(jìn)行篩選，于0.4 min/mL、0.5 min/mL、0.6 min/mL 流速依據(jù)方法測定，分別計(jì)算甘露醇峰面積RSD。結(jié)果RSD分別為0.76%、1.40%、1.40%。表明，流速變動符合系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求。

《中國藥典》2015 年版一部中收載的甘露醇含量測定方法均為滴定法，其測定的原理是氧化還原反應(yīng)，但因發(fā)酵蟲草菌粉（Cs-4）的發(fā)酵產(chǎn)物中含有還原性物質(zhì)，測定時(shí)會干擾結(jié)果的準(zhǔn)確性［6,7］。因此，本試驗(yàn)運(yùn)用HPLC-RID 法測定發(fā)酵蟲草菌粉（Cs-4）中甘露醇的含量，結(jié)果該方法操作簡單，穩(wěn)定可靠，準(zhǔn)確性高。依建立的測定方法測定13批樣品數(shù)據(jù)，結(jié)合以后工業(yè)化大生產(chǎn)可能出現(xiàn)的情況，因此暫定本品含甘露醇不得少于2.5%。

綜上所述，所建立的方法可作為發(fā)酵蟲草菌粉（Cs-4）的活性成分甘露醇的測定方法，為發(fā)酵蟲草菌粉（Cs-4）的全面質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。