孫麗鳳 楊華 陳偉

摘要 目的：研究自血療法對(duì)慢阻肺穩(wěn)定期模型大鼠白細(xì)胞介素-2（IL-2）、IL-6及C反應(yīng)蛋白（CRP）、降鈣素原（PCT）水平的影響。方法：選取60只健康清潔級(jí)雄性Wistar大鼠作為研究對(duì)象，將其以隨機(jī)抽簽法等分成空白對(duì)照組、空白觀察組以及自血療法組。其中空白觀察組及自血療法組大鼠均由熏香煙聯(lián)合氣道內(nèi)灌注毒素法制作慢阻肺穩(wěn)定期模型。完成后予以空白對(duì)照組、空白觀察組大鼠生理鹽水灌服，自血療法組大鼠則予以自血療法干預(yù)。3組大鼠均進(jìn)行30 d治療，比較治療前后血清IL-2、IL-6及CRP、PCT，血清基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）以及金屬蛋白酶抑制劑1（TIMP-1）變化情況。結(jié)果：治療后自血療法組大鼠IL-2、IL-6及CRP、PCT均低于空白觀察組，但高于空白對(duì)照組（均P<0.05）。治療后自血療法組大鼠血清MMP-9以及TIMP-1均低于空白觀察組，但高于空白對(duì)照組（均P<0.05）。結(jié)論：自血療法可顯著改善慢阻肺穩(wěn)定期模型大鼠的炎性反應(yīng)程度，降低血清MMP-9以及TIMP-1水平，可能成為臨床治療慢阻肺穩(wěn)定期的有效手段之一。

關(guān)鍵詞 慢性阻塞性肺疾病;穩(wěn)定期;大鼠模型;自血療法;炎性反應(yīng)因子

Abstract Objective：To analyze the effects of autohemotherapy on the levels of interleukin-2 （IL-2），IL-6，c-reactive protein （CRP） and procalcitonin （PCT） in rats with chronic obstructive pulmonary disease （COPD） in stable phase.Methods：A total of 60 healthy and clean male Wistar rats were selected and divided into blank control group， blank treatment group and autohemotherapy group by random lottery. Rats in the blank treatment group and the autohemotherapy group were modeled by cigarette smoking combined with intraairway toxin infusion. After modeling， the rats in the blank control group and the blank treatment group were drenched with normal saline， and the rats in the autohemotherapy group were given the autohemotherapy intervention. All rats in the three groups were treated for 30 days， the changes of serum IL-2， IL-6， CRP， PCT， serum matrix metalloproteinase-9 （MMP-9） and metalloproteinase inhibitor 1 （TIMP-1） before and after treatment were compared. Results：After treatment， the levels of IL-2，IL-6，CRP and PCT in the autohemotherapy group were lower than those in the blank treatment group， but was higher than the blank control group（all P<0.05）.After treatment， serum levels of MMP-9 and TIMP-1 in rats from the autohemotherapy group were lower than those in the blank treatment group， but was higher than the blank control group （all P<0.05）.Conclusion：Autohemotherapy can significantly alleviate the inflammatory response， reduce serum MMP-9 and TIMP-1 of the model rats. It may be one of the effective methods to treat chronic obstructive pulmonary disease in stable phase.

Keywords Chronic obstructive pulmonary disease; Stable phase; Rat model; Autohemotherapy; Inflammatory cytokines

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.12.015

慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）亦可稱(chēng)之為慢阻肺，主要是指一組以進(jìn)行性氣流受限為臨床表現(xiàn)特征的慢性疾病，該病的發(fā)生可能和香煙煙霧等有害氣體以及粉塵顆粒等引發(fā)的肺部炎性反應(yīng)有關(guān)，慢性炎性反應(yīng)導(dǎo)致的氣道損傷、重塑以及修復(fù)是該病主要病理改變[1-2]。該病患者主要癥狀囊括反復(fù)咳嗽咳痰、呼吸困難，伴或不伴有胸悶等，如不予以及時(shí)有效的治療，隨著病情的不斷進(jìn)展，會(huì)累及其他臟器、系統(tǒng)，繼而導(dǎo)致肺外不良反應(yīng)的發(fā)生，從而對(duì)患者的生命健康安全造成極大的威脅[3]。迄今為止，關(guān)于慢阻肺的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，大多數(shù)研究學(xué)者認(rèn)為其可能和免疫失衡、炎性反應(yīng)、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、氣道黏液過(guò)度分泌、細(xì)胞凋亡/組織重構(gòu)等密切相關(guān)[4]。臨床上針對(duì)慢阻肺尚無(wú)特異性治療手段，因此，尋找一種積極有效的治療手段顯得尤為重要，亦是目前臨床醫(yī)務(wù)人員以及患者共同關(guān)注的熱點(diǎn)。自血療法是近年來(lái)所興起的一種治療手段，其主要機(jī)制目前已得到大量研究證實(shí)[5-6]：血中含有較為豐富的血細(xì)胞、酶類(lèi)、激素以及補(bǔ)體等，通過(guò)自血療法治療可有效增強(qiáng)機(jī)體免疫力，并拮抗炎性反應(yīng)因子的釋放，減少嗜酸性粒細(xì)胞的合成、分泌，抑制乙酰膽堿等多種活性物質(zhì)的釋放。然而，關(guān)于自血療法治療慢阻肺穩(wěn)定期的相關(guān)基礎(chǔ)研究并不多見(jiàn)。由此，本文通過(guò)研究自血療法對(duì)慢阻肺穩(wěn)定期模型大鼠白細(xì)胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）及C反應(yīng)蛋白（C-reactive Protein，CRP）、降鈣素原（Procalcitonin，PCT）水平的影響，旨在探究自血療法治療慢阻肺穩(wěn)定期的主要機(jī)制，繼而為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，現(xiàn)作以下報(bào)道。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取60只健康清潔級(jí)雄性Wistar大鼠作為研究對(duì)象，將大鼠體質(zhì)量（180±20）g，均由天津市山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[許可證號(hào)：SCXK（津）2009-0001]。將所有大鼠均飼養(yǎng)在溫度18～22 ℃，相對(duì)濕度50%～70%的條件下，光照時(shí)間一致，每天晝夜各12 h，食物與水不進(jìn)行控制，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物 大腸桿菌內(nèi)毒素（SIGMA公司，美國(guó)，貨號(hào)：019034）;生理鹽水（上海信誼金朱藥業(yè)公司，貨號(hào)：227693）。

1.1.3 試劑與儀器 染毒箱（上海玉研科學(xué)儀器公司，型號(hào)：PLY5000）;IL-2、IL-6及CRP、PCT檢測(cè)試劑盒（均購(gòu)自eBioscience公司，美國(guó)，貨號(hào)分別為014207、102311、039148、026403）;MMP-9、TIMP-1檢測(cè)試劑盒（均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號(hào)分別為019112、019430）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 1）分組方式：將60只健康清潔級(jí)雄性Wistar大鼠以隨機(jī)抽簽法等分成空白對(duì)照組、空白觀察組以及自血療法組，每組20只。2）慢阻肺穩(wěn)定期大鼠模型的建立：通過(guò)熏香煙聯(lián)合氣道內(nèi)灌注毒素法制作慢阻肺穩(wěn)定期模型，即空白對(duì)照組大鼠予以正常空氣呼吸，而空白觀察組以及自血療法組大鼠每天放置于染毒箱內(nèi)被動(dòng)吸煙（大前門(mén)牌過(guò)濾嘴香煙），吸煙頻率為1支/次，30 min/次，2支/d，上午9：00及下午15：00各1支，連續(xù)熏煙30 d。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第1天以及第14天，空白觀察組以及自血療法組大鼠均予以乙醚吸入麻醉處理，隨后于氣道內(nèi)分別滴注200 μL大腸桿菌內(nèi)毒素與200 μL生理鹽水混合溶液，當(dāng)日不予以被動(dòng)吸煙處理。然后經(jīng)由上述方式造成慢阻肺，常規(guī)飼養(yǎng)14 d后達(dá)到穩(wěn)定期，即完成慢阻肺穩(wěn)定期大鼠模型的制作。

1.2.2 干預(yù)方法 待造模成功后，空白對(duì)照組、空白觀察組大鼠分別予以生理鹽水灌服治療，使用劑量為1 mL/100 g，1次/d。自血療法組大鼠則采用自血穴位注射療法治療，從第17天開(kāi)始進(jìn)行穴位注射，在每次注射時(shí)選擇兩穴點(diǎn)，包括肺俞穴（雙側(cè)）及腎俞穴（雙側(cè)），操作時(shí)輪流取穴，從大鼠的眼眶靜脈叢提取其自體血，單穴點(diǎn)給予0.4 mL的自體血注射，頻率為隔天1次，一共治療6次。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 比較治療前后血清IL-2、IL-6及CRP、PCT水平，血清基質(zhì)金屬蛋白酶-9（Matrix Metalloproteinase-9，MMP-9）以及金屬蛋白酶抑制劑1（Metalloproteinase Inhibitor 1，TIMP-1）水平的變化情況。其中血清IL-2、IL-6及CRP、PCT水平及血清MMP-9、TIMP-1水平以酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行檢測(cè)，具體操作務(wù)必以相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前后3組大鼠血清IL-2、IL-6及CRP、PCT水平 治療后自血療法組大鼠血清IL-2、IL-6及CRP、PCT水平均低于空白觀察組，但高于空白對(duì)照組（均P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 治療前后3組大鼠血清MMP-9以及TIMP-1水平比較 治療后自血療法組大鼠血清MMP-9以及TIMP-1水平均低于空白觀察組，但高于空白對(duì)照組（均P<0.05）。見(jiàn)表2、圖1。

3 討論

自血療法主要是基于經(jīng)絡(luò)學(xué)說(shuō)以及自體血液細(xì)胞多成分激發(fā)與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能原理所發(fā)展而來(lái)的一種治療疾病手段[7-9]。該治療方法在慢肺阻穩(wěn)定期的應(yīng)用越來(lái)越受到更多醫(yī)者的關(guān)注和認(rèn)可。IL-2是一種調(diào)節(jié)體液免疫的重要細(xì)胞因子;IL-6屬于多功能細(xì)胞因子之一，本質(zhì)乃是一種多肽類(lèi)物質(zhì)，多種外源性刺激均可能促進(jìn)正常細(xì)胞合成、分泌IL-6，是目前臨床上應(yīng)用較為廣泛的反映機(jī)體炎性反應(yīng)的敏感指標(biāo)[10-12];CRP屬于由肝臟合成的一種急性時(shí)相蛋白，在炎性反應(yīng)以及感染等狀態(tài)下顯著升高，是用以評(píng)價(jià)機(jī)體炎性反應(yīng)、感染嚴(yán)重程度的客觀指標(biāo);PCT屬于降鈣素的前肽物之一，在正常生理狀態(tài)下不表達(dá)或極低表達(dá)，一旦發(fā)生感染或炎性反應(yīng)時(shí)，其水平大幅度上升[13-14]。目前，臨床上已有不少研究報(bào)道證實(shí)，上述4項(xiàng)指標(biāo)可用以反映慢肺阻的嚴(yán)重程度以及預(yù)后評(píng)估[15-16]。本文通過(guò)研究自血療法對(duì)慢阻肺穩(wěn)定期模型大鼠IL-2、IL-6及CRP、PCT水平的影響，以期進(jìn)一步探討自血療法應(yīng)用于慢阻肺的可行性和作用機(jī)制。

本文結(jié)果顯示，治療后自血療法組大鼠IL-2、IL-6及CRP、PCT水平均低于空白觀察組，但高于空白對(duì)照組，這說(shuō)明了自血療法可明顯降低慢阻肺穩(wěn)定期模型大鼠的炎性反應(yīng)因子。分析原因，我們認(rèn)為可能與該療法有效促進(jìn)機(jī)體免疫力的恢復(fù)以及抑制炎性反應(yīng)遞質(zhì)的釋放有關(guān)[17-18]。另外，治療后自血療法組大鼠血清MMP-9以及TIMP-1水平均低于空白觀察組，但高于空白對(duì)照組，這提示了自血療法應(yīng)用于慢阻肺穩(wěn)定期模型大鼠治療中，可顯著改善MMP-9以及TIMP-1水平。其中MMP-9屬于明膠酶之一，可發(fā)揮降解氣道與肺的細(xì)胞外基質(zhì)、基質(zhì)膜的作用，進(jìn)一步引起肺泡表面以及肺彈性蛋白不可逆性損害以及肺結(jié)構(gòu)重塑，在慢阻肺的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。另有相關(guān)研究報(bào)道證實(shí)[19-20]，MMP-9可通過(guò)趨化炎性細(xì)胞聚集，從而加劇肺組織炎性反應(yīng)，導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)的破壞，進(jìn)一步引起氣道重塑，最終引起氣流阻塞。TIMP-1則屬于MMP-9的一種內(nèi)源性抑制劑，屬于呼吸道重構(gòu)的重要因子之一，與MMP-9共同作用參與支氣管以及肺泡壁的進(jìn)行性破壞以及不可逆呼吸道重構(gòu)過(guò)程。正常生理狀況下，MMP-9和TIMP-1處于相對(duì)平衡狀態(tài)，若比值升高反映氣道以炎性反應(yīng)為主，若比值降低則反映以修復(fù)為主。因此，可推測(cè)自血療法應(yīng)用于慢阻肺穩(wěn)定期模型大鼠中的主要機(jī)制可能和調(diào)節(jié)MMP-9和TIMP-1水平有關(guān)。

綜上所述，自血療法應(yīng)用于慢阻肺穩(wěn)定期模型大鼠的治療中，可明顯改善大鼠的炎性反應(yīng)程度。此外，MMP-9和TIMP-1水平的調(diào)節(jié)可能是自血療法治療阻肺穩(wěn)定期的重要機(jī)制。

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（2019-08-14收稿 責(zé)任編輯：王明）