白現(xiàn)廣 王惠平 劉永瑩 郝麗亞 齊閃閃 范衛(wèi)衛(wèi)

摘要：目的：優(yōu)化野菊花總黃酮的提取工藝，為野菊花總黃酮的開發(fā)和利用提供基礎(chǔ)。方法：通過正交試驗的方法，以野菊花的總黃酮含量作為指標，從溶劑濃度、料液比、提取溫度、提取時間4個因素，篩選野菊花總黃酮的最佳提取工藝。結(jié)果：乙醇法提取野菊花總黃酮的最佳工藝條件為乙醇濃度80%、料液比1：25、溫度80℃、提取時間2h，提取率為4.90%。結(jié)論：通過正交試驗對野菊花總黃酮的提取工藝進行優(yōu)化，可提高野菊花總黃酮的提取率。

關(guān)鍵詞：野菊花;總黃酮;提取

中圖分類號：R284.2 文獻標志碼：A

野菊花是菊科植物野菊（Chrysanthemum indiellm）的干燥頭狀花序，性微寒，具有散風熱、平肝明目之功效，是臨床常用中草藥。研究表明，野菊花中含有黃酮類、三萜類和揮發(fā)油等化學成分。其中，總黃酮是野菊花發(fā)揮藥理作用的最重要的活性成分之一，具有保護心腦血管系統(tǒng)、抗氧化、保肝、抗炎、抗腫瘤等藥理作用。目前野菊花總黃酮提取工藝主要包括：有機溶劑提取法、微波提取法、酶輔助提取法及超聲波提取法等。本實驗使用乙醇為有機溶劑提取野菊花中的總黃酮，通過單因素考察和正交試驗優(yōu)化確定野菊花總黃酮乙醇提取法的最佳工藝條件，為野菊花總黃酮的進一步研究、開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1實驗材料與儀器

1.1實驗材料與試劑

實驗材料：野菊花于2018年10月采自平頂山市新華區(qū)落鳧山南坡，經(jīng)平頂山學院醫(yī)學院范衛(wèi)衛(wèi)博士鑒定為菊科植物野菊（Chrysanthemum indicum）。

實驗試劑：蘆丁標準品（純度≥98%）購自合肥博美生物科技有限責任公司;亞硝酸鈉（分析純）購自洛陽吳華化學試劑有限公司;硝酸鋁（分析純）購自國藥集團化學試劑有限公司;氫氧化鈉（分析純）購自天津市大茂化學試劑廠;乙醇（分析純）購自天津市德恩化學試劑有限公司。

1.2儀器設(shè)備

FAl004N型電子天平（上海菁海儀器有限公司）;DZKw-4型電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）;DHG-9202-1S型電熱恒溫干燥箱（上海鴻都電子科技有限公司）;SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（河南省予華儀器有限公司）;T6型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）;XT-350型高速多功能粉碎機（浙江永康市紅太陽機電有限公司）;1830c型純水機（重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司）。

2實驗方法

2.1原材料處理

新鮮野菊花放入65℃干燥箱烘干至恒重，高速粉碎機粉碎，過60目篩，密封，干燥通風處儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2總黃酮的提取方法

野菊花干燥粉末，乙醇浸提，抽濾，得到含總黃酮浸提物。設(shè)計不同乙醇濃度、不同料液比、不同提取溫度、不同提取時間進行單因素考察及正交試驗，以野菊花總黃酮得率為指標，確定野菊花中總黃酮的最佳提取條件。

2.3總黃酮含量的測定

采用硝酸鋁比色法，以蘆丁（標準樣）做標準，使用紫外分光光度計在510 nm波長處比色，測定野菊花中總黃酮的含量。

2.4蘆丁標準溶液配置及標準曲線繪制

分析天平精密量取20 mg蘆丁標準品于100 mL容量瓶，用60%乙醇進行定容，得到0.2 mg/mL的標準溶液。移液管分別移取0 mL，1.0 mL，2.0 mL，3.0 mL，4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL蘆丁標準溶液于25 mL容量瓶。每個容量瓶先分別移取5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻并靜置于實驗臺6min，再分別加入10%硝酸鋁溶液1.0mL，搖勻并靜置于實驗臺6 min，最后分別加入4%氫氧化鈉溶液10.0mL，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻并靜置于實驗臺15 min，使用紫外分光光度計在510 nm波長處測定各瓶溶液的吸光度，以吸光度A作為縱坐標，蘆丁標準溶液的濃度c作為橫坐標，繪制標準曲線如圖1所示，并計算回歸方程。處理實驗數(shù)據(jù)后，得到標準曲線的回歸方程如下：

2.5總黃酮提取率的計算

黃酮提取率（%）=（待測液總黃酮的濃度x50x25）/（吸取的待測液體積XmxlOOO）x100%;

其中，50為濾液定容時所用的體積（mL）;25為測吸光度A時定容所用的體積（mL）;m為所取藥物質(zhì)量（g）。

2.6正交設(shè)計

影響野菊花總黃酮含量的因素主要有提取溶劑的濃度（A）、料液比（B）、提取溫度（C）以及提取時間（D），用這些因素設(shè)計L9（3⁴）因素水平表，見表1所列。

3實驗結(jié)果與分析

3.1提取工藝單因素實驗的結(jié)果與分析

3.1.1提取溶劑濃度

在料液比1：15、提取時間1 h、提取溫度50℃的條件下，研究提取醇濃度對總黃酮提取效果的影響，結(jié)果如圖2所示。隨著醇濃度的增大，曲線呈上升趨勢，在70%醇濃度時達到最大值，說明此時黃酮提取率最大，隨后曲線開始降低。因此，應選取70%的乙醇作為提取黃酮類化合物的最佳提取濃度。在提取溶劑濃度為70%的乙醇溶液時，野菊花總黃酮的含量為44.68 mg/g，提取率為4.47%。

3.1.2液料比

在醇濃度50%、提取時間1 h、提取溫度50℃的條件下，研究料液比對總黃酮提取效果的影響，結(jié)果如圖3所示。隨著料液比的增加，曲線呈上升趨勢，在料液比為1：20時達到最大值，說明此時黃酮提取率最大，隨后曲線降低。因此，提取黃酮類化合物的最佳提取料液比應選取20：1。提取溶劑的料液比為20：1時，野菊花總黃酮的含量為45.44 mg/g，提取率為4.54%。

3.1.3提取溫度

在醇濃度50%、料液比1：15、提取時間1 h的條件下，研究提取溫度對總黃酮提取效果的影響，結(jié)果如圖4所示。隨著溫度的升高，曲線呈上升趨勢，80℃時達最高點，說明此時黃酮提取率最大，溫度繼續(xù)升高，曲線下降。因此，應選取80℃作為提取黃酮類化合物的最佳提取溫度。提取溫度為80℃時，野菊花總黃酮的含量為40.67 mg/g，提取率為4.07%。

3.1.4提取時間

由圖5可以看出，在料液比1：15、醇濃度50%、溫度50℃的條件下，研究提取時間對總黃酮提取效果的影響，隨著時間的增長，曲線先呈上升趨勢，在1.5 h時達到最高點，而后下降，說明此時黃酮提取率最大。因此提取的最佳時間為1.5 h，此時野菊花總黃酮的含量為41.54 mg/g，提取率為4.15%。

3.2正交實驗結(jié)果與分析

正交實驗結(jié)果見表2所列，根據(jù)表2中R值可知，A>D>c>B，故總黃酮提取率主要影響因素為提取溶劑的濃度，影響最小的是料液比。由表2可知實驗的最佳提取工藝為A3、B3、C2、D，，即提取溶劑的濃度為80%、提取時間為2 h、料液比為1：25、提取溫度為80℃。

野菊花總黃酮最佳提取工藝驗證：取野菊花原料1.0 g，按料液比為1：25向其中加入80%醇25 mL，水浴回流溫度為80℃，提取2 h，平行實驗三次，結(jié)果見表3所列。相對標準偏差（RSD）值為0.89%，證明此提取工藝可行。

4結(jié)論

本研究利用乙醇法提取野菊花總黃酮，通過單因素分析和正交試驗探究了野菊花總黃酮提取的影響因素和最佳工藝條件。結(jié)果表明，野菊花總黃酮提取的最佳工藝條件為提取溶劑乙醇濃度為80%、提取時間為2 h、料液比為1：25、溫度80℃，此時黃酮的含量為49.01 mg/g，在該條件下，野菊花總黃酮的提取率最高，為4.90%。