溫艷艷 張靜 朱雅琴

摘要 [目的]優(yōu)化CO2超臨界萃取孢子油后的破壁靈芝孢子粉殘?jiān)推票陟`芝孢子粉中三萜類成分提取工藝以及CO2超臨界萃取孢子油前后三萜類成分的含量差異。[方法]通過設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，采用紫外-可見分光光度法測(cè)量提取液的吸光度，計(jì)算提取率，根據(jù)正交數(shù)據(jù)分析，確定最佳提取方案以及含量差異。[結(jié)果]對(duì)于CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉來說，最佳提取工藝為以無(wú)水乙醇作為提取溶劑，料液比為1∶30（g∶mL），提取時(shí)間為2 h，提取溫度為70 ℃，提取次數(shù)為4次時(shí)提取率最高;對(duì)于破壁靈芝孢子粉來說，最佳提取工藝為以無(wú)水乙醇為提取溶劑，料液比為1∶20，提取時(shí)間為1.5 h，提取溫度為50 ?℃，提取次數(shù)2次時(shí)提取率最高;且二者三萜類成分含量存在于有明顯差異。[結(jié)論]該研究為進(jìn)一步分析破壁靈芝孢子粉在CO2超臨界萃取孢子油前后三萜類成分含量差異提供理論依據(jù)和參考。

關(guān)鍵詞 破壁靈芝孢子粉;提取工藝優(yōu)化;含量測(cè)定;方法學(xué)考察;正交試驗(yàn)設(shè)計(jì);紫外-可見分光光度法

中圖分類號(hào) R284 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2020）19-0182-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.19.048

Abstract [Objective]To optimize the extraction process of triterpenoids from the residues of spore powder of Ganoderma lucidum and spores of Ganoderma lucidum after CO2 supercritical extraction of spore oil and the difference of triterpenoids content before and after CO2 supercritical extraction of spore oil.[Method]By designing an orthogonal experiment，the absorbance of the extract was measured by UVvis spectrophotometry，the extraction rate was calculated，and the optimal extraction scheme and content difference were determined based on the orthogonal data analysis.[Result]The best extraction process for the broken Ganoderma lucidum spore powder after CO2 supercritical extraction of Ganoderma lucidum spore oil： absolute ethanol as the extraction solvent，the solidliquid ratio was 1∶30，and the extraction rate was highest when the temperature was 70 ?℃ for 2 h and the number of times was 4 times.For Ganoderma lucidum spore powder，the best extraction process was： using absolute ethanol as the extraction solvent，the solidliquid ratio was 1∶20，the extraction time was 1.5 h，the extraction temperature was 50 ℃，and the extraction rate is the highest;and the content of triterpenoids in the two was significantly different.[Conclusion]The study provides a theoretical basis and reference for further analysis of the content difference of triterpenes in the broken Ganoderma lucidum spore powder before and after CO2 supercritical extraction of spore oil.

Key words Broken Ganoderma lucidum spore powder;Optimization of extraction process;Content determination;Methodological investigation;Orthogonal experimental design;Ultravioletvisible spectrophotometry

基金項(xiàng)目 安徽省科技重大專項(xiàng)（17030801015）。

作者簡(jiǎn)介 溫艷艷（1995—），女，安徽濉溪人，碩士研究生，研究方向：藥學(xué)。*通信作者，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事藥物制劑新技術(shù)與藥物體內(nèi)外分析研究。

收稿日期 2020-01-03;修回日期 2020-03-06

靈芝（Ganodermo lucidum）屬于擔(dān)子菌綱多孔菌科真菌，是我國(guó)名貴的傳統(tǒng)中藥材，在中國(guó)有上千年的藥用歷史，又名“瓊珍”，被歷代醫(yī)藥家視為滋補(bǔ)強(qiáng)壯、扶正固本的神奇珍品[1]。靈芝孢子粉是在靈芝成熟后從菌褶中彈射出來的微小的生殖細(xì)胞，也是靈芝的種子，具有靈芝的全部遺傳物質(zhì)，其形態(tài)極其微?。?～6 μm），一般條件下想要自然收集很困難。近年來經(jīng)證實(shí)靈芝孢子粉主要具有抗癌抗腫瘤活性[2-4]、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)[5-6]、保肝護(hù)肝[7-8]、降血脂[9]、降血糖[10]、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力[11-12]等作用。此外，靈芝孢子粉類藥物被廣泛應(yīng)用于臨床方面，且安全無(wú)毒。

靈芝三萜一般可以從不同種類的靈芝中分離提純獲得，且靈芝三萜在靈芝中的含量多少常被作為評(píng)判靈芝質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)之一[13]。1982年，Kubota等[14]首次從靈芝中分離出2種靈芝酸成分，即靈芝酸A、B，目前為止已鑒定出的靈芝三萜的種類達(dá)300多種[15]。靈芝三萜類成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有高度氧化性的羊毛甾烷衍生物，分子量一般在400～600 Da，脂溶性較高，難溶于水。三萜多數(shù)具有苦味，苦味越強(qiáng)則三萜含量越高，從靈芝子實(shí)體、孢子粉、菌絲體等的提取物中分離出多種三萜類成分，大多數(shù)以靈芝酸為主[16]。

破壁靈芝孢子粉價(jià)格昂貴，且對(duì)于考察靈芝孢子粉的質(zhì)量目前沒有一個(gè)確切的科學(xué)評(píng)價(jià)體系，對(duì)于其藥理作用、臨床應(yīng)用以及相關(guān)藥物研發(fā)領(lǐng)域研究等都發(fā)現(xiàn)與其活性成分密切相關(guān)。有研究表明，破壁靈芝孢子粉CO2超臨界萃取孢子油后，其中三萜類成分也會(huì)相應(yīng)地被提取出來[17]，為避免資源浪費(fèi)，對(duì)其中剩余三萜類成分進(jìn)行提取，可以實(shí)現(xiàn)資源利用最大化。

應(yīng)要求采用有機(jī)溶劑回流提取法對(duì)兩類破壁靈芝孢子粉中三萜類成分進(jìn)行提取，在提取過程中，提取溶劑、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比等都會(huì)對(duì)提取率有一定的影響，因此采用正交法對(duì)提取方案進(jìn)行優(yōu)化，正交設(shè)計(jì)作為一種高效經(jīng)濟(jì)且可以同時(shí)對(duì)多種影響因素進(jìn)行考察的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法[18]，可以有效選取對(duì)靈芝孢子粉中三萜類成分提取的最優(yōu)影響因素，獲得最佳提取工藝，近年來被廣泛應(yīng)用于中藥領(lǐng)域，尤其是中藥中有效成分的提取分離。筆者通過紫外-可見分光光度法進(jìn)行含量測(cè)定，比較萃取靈芝孢子油前后三萜類成分含量差異，從而更客觀地評(píng)價(jià)靈芝孢子粉質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材。

CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉殘?jiān)?、破壁靈芝孢子粉，由黃山云樂靈芝有限公司提供。

1.1.2 試劑。

無(wú)水甲醇、無(wú)水乙醇、冰醋酸、香草醛、乙酸乙酯，上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司，均為分析純;高氯酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，優(yōu)級(jí)純;齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，純度： HPLC≥98%，批號(hào) CHB171229，成都克洛瑪生物科技有限公司。

1.1.3 儀器。

十萬(wàn)分之一分析天平、千分之一分析天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)heidolph;恒溫水浴鍋，上海越眾儀器設(shè)備有限公司;紫外-可見分光光度計(jì)，UV-8000，上海元析分析儀器有限公司;SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵，河南省予華儀器有限公司;抽濾裝置，北京欣維爾玻璃儀器有限公司;全波長(zhǎng)掃描儀，德國(guó)耶拿分析儀器股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的配制。

精密稱取齊墩果酸對(duì)照品10.00 mg，用無(wú)水甲醇溶解，配制成0.2 mg/mL的溶液，待用。

1.2.2 供試品溶液的制備。

精密稱量2 g破壁靈芝孢子粉、CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉殘?jiān)?，分別置于500 mL容量瓶中，通過設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，在不同試驗(yàn)條件下對(duì)破壁靈芝孢子粉、CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉殘?jiān)謩e進(jìn)行有機(jī)溶劑回流提取三萜類成分，將提取液經(jīng)減壓抽濾，合并濾液，對(duì)獲得的澄清濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于70 ℃水浴濃縮至少于25 mL，采用25 mL容量瓶用相應(yīng)的提取溶劑進(jìn)行定容至25 mL混勻，制得供試品溶液。

1.2.3 最大吸收波長(zhǎng)的確定。

精密量取0.6 mL對(duì)照品溶液于10 mL試管中，于50 ℃烘箱中揮干，放冷，精密加入0.2 mL香草醛冰醋酸溶液（精密稱量香草醛粉末500 mg，置于10 mL容量瓶中，用冰醋酸配制成50 mg/mL的香草醛冰醋酸溶液）、0.8 mL高氯酸溶液，混勻，于70 ℃水浴加熱15 min，取出，冰浴5 min，精密加入乙酸乙酯4 mL，混勻，制得待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液;并用相應(yīng)試劑制備空白溶液，作為參比溶液，利用紫外全波長(zhǎng)掃描儀于200～800 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，繪制吸光度-波長(zhǎng)曲線，確定最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.4 方法學(xué)考察。

1.2.4.1 線性關(guān)系考察。分別

精密量取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL試管中，自揮干起，按“1.2.3”中同法操作，于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制吸光度（y）與濃度（x）曲線，計(jì)算線性回歸方程。

1.2.4.2 精密度。

精密量取對(duì)照品溶液0.6 mL，于10 mL試管中，自揮干起，按“1.2.3”中同法操作，于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算RSD。

1.2.4.3 重復(fù)性。精密量取100 μL CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉的供試品溶液、25 μL破壁靈芝孢子粉的供試品溶液，各6份于10 mL試管中，自揮干起，按“1.2.3”中同法操作，于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD。

1.2.4.4 穩(wěn)定性。

精密量取100 μL CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉的供試品溶液、25 μL破壁靈芝孢子粉的供試品溶液于10 mL試管中，自揮干起，按“1.2.3”中同法操作，于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，每隔10 min測(cè)定一次吸光度，測(cè)定1 h，自第2小時(shí)起，每隔1 h測(cè)定一次吸光度，計(jì)算RSD。

1.2.4.5 加樣回收率。分別精確吸取已知三萜含量的CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉供試品溶液50 μL于9支10 mL試管中，分成3份，分別加入1∶0.8、1∶1.0、1∶1.2對(duì)照品溶液，自揮干起，按“1.2.3”中同法操作，于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率和RSD。

分別精確吸取破壁靈芝孢子粉供試品溶液5 μL于9支10 mL試管中，分成3份，按上述方法加入對(duì)照品溶液，并同法操作。

1.2.5 靈芝三萜含量測(cè)定。

精密量取100 μL CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉的供試品溶液、25 μL破壁靈芝孢子粉的供試品溶液于10 mL試管中，自揮干起，按“1.2.3”中同法操作，于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)線性回歸方程，計(jì)算靈芝三萜的含量。

1.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 該試驗(yàn)主要采用有機(jī)溶劑回流提取，考察提取溶劑（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）、提取溫度（D）、提取次數(shù)（E）5個(gè)因素對(duì)CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉和破壁靈芝孢子粉中三萜類成分提取率的影響，設(shè)計(jì)L16（45）正交試驗(yàn)，見表1。

1.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，獲得最佳試驗(yàn)方案，在最佳試驗(yàn)方案條件下提取破壁靈芝孢子粉、CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉中的三萜類成分，并測(cè)定三萜類成分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng) 從靈芝三萜類成分在200～800 nm的吸光度-波長(zhǎng)曲線（圖1）可以看出，靈芝三萜類成分在波長(zhǎng)為548 nm處獲得最大吸光度，因此選擇548 nm作為最大吸收波長(zhǎng)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察。按“1.2.4.1”操作，計(jì)算得出線性回

歸方程y=2.290 2x-0.086 6，R2=0.999 1（n=6），結(jié)果表明三萜濃度在8.00～41.00 μg/mL穩(wěn)定。

2.2.2 精密度。按“1.2.4.2”操作，計(jì)算出吸光度的RSD為0.077%（n=6），表明儀器具有較好的精密度。

2.2.3 重復(fù)性。按“1.2.4.3”操作，計(jì)算出CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉、破壁靈芝孢子粉三萜提取液吸光度的RSD分別為0.253%、1.254%（n=6），表明該方法重復(fù)性較好。

2.2.4 穩(wěn)定性。按“1.2.4.4”操作，計(jì)算出CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉的三萜提取液2 h內(nèi)吸光度的RSD為1.650%，表明在2 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性;破壁靈芝孢子粉三萜提取液在1 h內(nèi)吸光度的RSD為1.157%，表明該方法在1 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

2.2.5 加樣回收率。按“1.2.4.5”操作，破壁靈芝孢子粉和CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉三萜提取液加樣回收率結(jié)果見表2、3，表明該方法準(zhǔn)確、可靠，適用于三萜類成分的測(cè)定。

2.3 正交試驗(yàn)

由表4可知，對(duì)于破壁靈芝孢子粉來說，各提取因素對(duì)其三萜提取率的影響從大到小依次為A、D、B、E、C，破壁孢子粉三萜最佳提取工藝為A3B1C2D1E2，即無(wú)水乙醇為提取溶劑，料液比為1∶20（g∶mL），提取時(shí)間1.5 h，提取溫度50 ℃，提取次數(shù)2次。對(duì)于CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁孢子粉來說，各因素對(duì)三萜提取率的影響從大到小依次為B、E、A、D、C，CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉三萜最佳提取工藝為A3B2C3D3E4，即無(wú)水乙醇為提取溶劑，料液比為1∶30，提取時(shí)間2.0 h，提取溫度70 ℃，提取次數(shù)4次。

為分析不同影響因素對(duì)兩類破壁靈芝孢子粉中三萜類成分提取率影響的顯著性，對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提取溶劑、料液比、提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)對(duì)靈芝三萜類成分提取率均具有顯著影響（P<0.05）。對(duì)于破壁靈芝孢子粉，提取溶劑對(duì)其提取率影響較大;對(duì)于CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉，料液比是影響其提取率的主要因素。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)經(jīng)正交試驗(yàn)得到的最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證，得CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉三萜提取率為1.69%，破壁靈芝孢子粉三萜提取率為12.29%，故證明所確定的2種提取工藝為最佳提取工藝。

3 結(jié)論與討論

由方法學(xué)考察結(jié)果可知，采用紫外-可見分光光度法測(cè)定靈芝孢子粉中三萜類成分的可行性良好。通過正交試驗(yàn)考察提取溶劑、料液比、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)兩類破壁孢子粉三萜提取率的影響，發(fā)現(xiàn)在一定程度下不同因素對(duì)兩類破壁靈芝孢子粉提取率的影響不盡相同，對(duì)于破壁靈芝孢子粉，提取溶劑對(duì)其提取率影響較大，且其最佳提取工藝為無(wú)水乙醇作為提取溶劑，料液比為1∶20，提取時(shí)間為1.5 h，提取溫度為50 ℃，提取次數(shù)2次;對(duì)于CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉，料液比是影響其提取率的主要因素，且最佳提取工藝為無(wú)水乙醇為提取溶劑，料液比為1∶30，提取時(shí)間為2.0 h，提取溫度為70 ℃，提取次數(shù)4次。

目前多數(shù)學(xué)者多采用有機(jī)溶劑作為提取溶劑，相對(duì)于氯仿、乙酸乙酯來說不同濃度乙醇、甲醇毒性較小，價(jià)廉易得，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。回流提取具有提取量大、操作簡(jiǎn)單、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，目前被廣泛應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)方案，對(duì)各種因素的影響進(jìn)行綜合考察，進(jìn)一步縮短試驗(yàn)時(shí)間，減少資源損耗。采用紫外-可見分光光度法進(jìn)行含量測(cè)定，并進(jìn)行方法學(xué)試驗(yàn)考察該方法的可靠性，然后根據(jù)試驗(yàn)中測(cè)得的吸光度計(jì)算兩類孢子粉中三萜類成分的提取率，比較含量差異，并根據(jù)正交試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，探討各因素對(duì)結(jié)果的影響效果，綜合考察得出最佳提取工藝。

參考文獻(xiàn)

[1] 楊曉青，王旭.靈芝孢子粉最新應(yīng)用研究概況[J].江蘇中醫(yī)藥，2018，50（4）：87-89.

[2] ZHAO H，ZHANG Q Y，ZHAO L，et al.Spore powder of Ganoderma lucidum improves cancerrelated fatigue in breast cancer patients undergoing endocrine therapy： A pilot clinical trial[J].Evidencebased complementray and alternative medicine，2012，2012：1-8.

[3] GAO P，HIRANO T，CHEN Z Q，et al.Isolation and identification of C19 fatty acids with antitumor activity from the spores of Ganoderma lucidum （reishi mushroom）[J].Fitoterapia，2012，83（3）：490-499.

[4] NA K，LI K，SANG T T，et al.Anticarcinogenic effects of water extract of sporodermbroken spores of Ganoderma lucidum on colorectal cancer in vitro and in vivo[J].International journal of oncology，2017，50（5）：1541-1554.

[5] ZHOU Y，QU Z Q，ZENG Y S，et al.Neuroprotective effect of preadministration with Ganoderma lucidum spore on rat hippocampus[J].Experimental and toxicologic pathology，2011，64（7/8）：673-680.

[6] WANG F F，WANG S Q，SHAO S，et al.Effects of Ganoderma lucidum spore power on expression of Ncadherin and neurotrophin4 in the brains of epileptic rats[J].Chinese journal of pathophysiology，2011，27（5）：1003-1007.

[7] 趙燕平，余亞平，胡潔.破壁靈芝孢子粉對(duì)刀豆蛋白A誘導(dǎo)免疫損傷小鼠外周血CD4+和CD8+細(xì)胞因子水平的影響及護(hù)肝作用[J].浙江中醫(yī)雜志，2017，52（12）：877-878.

[8] 楊麗麗，鄧志欽，黃維淵，等.靈芝孢子粉對(duì)抗亞急性酒精性肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2013，24（3）：513-514.

[9] 王亞東，王海玉，張桂霞，等.三七和靈芝孢子粉提取物對(duì)高血脂模型大鼠降血脂作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2006，13（6）：1452-1453.

[10] 姜余梅，楊艷，陳曉?shī)?，?靈芝孢子和抗性淀粉對(duì)糖尿病大鼠糖脂代謝及氧化應(yīng)激的協(xié)同干預(yù)[J].食品科學(xué)，2014，35（23）：288-291.

[11] 張榮標(biāo)，陳潤(rùn)，陳冠敏，等.破壁靈芝孢子粉對(duì)小鼠免疫功能影響的研究[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇，2013，19（12）：936-938，954.

[12] 彭亮，趙鵬，李彬，等.破壁靈芝孢子粉對(duì)小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].應(yīng)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2011，17（4）：241-243.

[13] 崔月花，章克昌.靈芝三萜皂苷（GCTL1）的體外抗氧化作用[J].食品科學(xué)，2010，31（19）：49-53.

[14] KUBOTA T，ASAKA Y，MIURA I，et al.Structures of ganoderic acid A and B，two new lanostane type bitter triterpenes from Ganoderma lucidum （FR.） KARST.[J].Helvetica chimica acta，1982，65（2）：611-619.

[15] XIA Q，ZHANG H Z，SUN X F，et al.A comprehensive review of the structure elucidation and biological activity of triterpenoids from Ganoderma spp.[J].Molecules，2014，19（11）：17478-17535.

[16] 劉維，虎虓真，朱莉，等.靈芝三萜的研究與應(yīng)用進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2019，40（5）：309-315.

[17] 盧錦熙，曾榮華，王騰華，等.靈芝孢子油化學(xué)成分研究[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，30（4）：553-557.

[18] 黑銀秀，余山紅，劉君，等.應(yīng)用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化冰菜扦插方法[J].中國(guó)蔬菜，2019（4）：51-54.