摘要 [目的]研究外源水楊酸對烏龍茶咖啡堿合成代謝的影響。[方法]以烏龍茶品種“鐵觀音”幼苗為試驗材料，分析外源水楊酸對烏龍茶葉片咖啡堿含量、咖啡堿合成酶基因表達及其合成途徑中間代謝產(chǎn)物含量的影響。[結(jié)果]外源水楊酸提高烏龍茶葉片咖啡堿含量、激活烏龍茶咖啡堿合成酶的基因表達，增加咖啡堿可可堿、1，7-二甲基黃嘌呤和茶堿等合成途徑中間產(chǎn)物的含量，有利于咖啡堿的累積。[結(jié)論]水楊酸對咖啡堿生物合成具有濃度效應(yīng)，2.0 mmol/L 水楊酸最有利于鐵觀音咖啡堿的生物合成。

關(guān)鍵詞 鐵觀音;外源水楊酸;咖啡堿;生理特性;基因表達

中圖分類號 S571.1 ?文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）19-0048-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.19.014

Abstract [Objective]To study the effects of exogenous salicylic acid on the synthesis and metabolism of caffeine in Oolong tea.[Method]The seedlings of Tieguanyin，a oolong tea variety，were used to study the effects of different concentrations of salicylic acid on the gene expression of caffeine，caffeine synthetase and the content of intermediate products of caffeine synthesis pathway.[Result]Exogenous salicylic acid increased the content of caffeine in Oolong tea，activated the gene expression of caffeine synthetase，and increased the content of theobromine，1，7dimethylxanthine and theophylline，the intermediate products of caffeine synthesis pathway，so as to promote the biosynthesis of caffeine.[Conclusion]Salicylic acid has a concentration effect on caffeine metabolism，2.0 mmol/L salicylic acid is the most favorable for caffeine production.

Key words Tieguanyin;Exogenous salicylic acid;Caffeine;Physiological characteristics;Gene expression

基金項目 福建省產(chǎn)業(yè)技術(shù)聯(lián)合創(chuàng)新項目（閩發(fā)改高技〔2014〕514號）;泉州市科技計劃項目（2018N16）。

作者簡介 蔡金福（1977—），男，福建南安人，高級農(nóng)藝師，從事茶樹品種選育與高效生產(chǎn)技術(shù)研究。

收稿日期 2019-12-18;修回日期 2020-03-06

福建是全國最大的烏龍茶生產(chǎn)省份和發(fā)源地，生產(chǎn)歷史悠久，產(chǎn)品特色明顯，在國內(nèi)外市場享有較高的聲譽。福建素有“茶樹良種王國”之稱，也是國內(nèi)烏龍茶茶樹品種資源最豐富的地區(qū)[1]。茶葉品質(zhì)主要包括茶葉中的氨基酸指數(shù)以及茶多酚的含量，還包括咖啡堿以及可溶性糖的含量等?？Х葔A是茶湯中苦味的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，對茶葉品質(zhì)有非常重要的影響[2]。它具有興奮神經(jīng)中樞、提神和醒腦的功效，同時對人的呼吸和心臟系統(tǒng)也有興奮作用[3]。另外，咖啡堿在治療癌癥、阿爾茲海默病、帕金森病[4]等方面也有一定的作用。

水楊酸是小分子酚類化合物，普遍存在于植物體內(nèi)，通過調(diào)節(jié)植物的各代謝途徑，從而誘導植物體內(nèi)合成酚類、黃酮類等次生代謝產(chǎn)物[5-6]。外源水楊酸在植物抗性應(yīng)用方面已有相關(guān)報道[7-9]，咖啡堿代謝研究主要集中于微生物發(fā)酵、外源誘導物ZMZ和合成基因功能等方面[10-11]，利用外源水楊酸調(diào)節(jié)咖啡堿代謝的研究鮮見報道[12]。鑒于此，筆者對 “鐵觀音”2年生盆栽苗噴施外源水楊酸進行了研究，分析烏龍茶葉片咖啡堿含量、咖啡堿合成酶基因表達和咖啡堿合成途徑中前體物質(zhì)含量的變化，探索烏龍茶樹咖啡堿生物合成的生理特性，旨在為烏龍茶高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以種植于安溪縣茶葉生產(chǎn)基地內(nèi)的2年生“鐵觀音”烏龍茶幼苗為材料，鐵觀音幼苗健康且生長健壯。將鐵觀音幼苗種植于塑料盆中，每盆種植3株;培養(yǎng)1個月，待幼苗正常生長后，選取枝梢長勢相對一致的盆栽苗用于試驗。

1.2 試驗設(shè)計

2019年4—5月對茶樹進行噴施水楊酸處理，濃度分別為1.0、2.0、3.0和4.0 mmol/L，對照處理為蒸餾水，共設(shè)計5個處理，每盆為1個處理，每個處理3次重復(fù)，隨機區(qū)組設(shè)計，各處理間隔50 cm擺放。在晴朗天氣09：00前葉面噴施水楊酸，每個星期噴施1次，共處理4次;試驗期間用塑料薄膜遮擋自然降雨，其他按茶園田間管理進行。試驗結(jié)束后采集成熟功能性葉片用于各項生理指標測定，葉片選取位于相同方向和節(jié)位的枝條。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 樣品的制備。各處理采集的茶葉樣品分為2份，其中1份烘干制備成干樣，另1份用新鮮樣品;樣品分別采用熱水浸提、熱水超聲波、75%乙醇浸提、75%乙醇超聲波4種方式進行提取待測液。提取方法為：稱取樣品150 mg，置于25 mL燒瓶中，加入沸水（或75%乙醇）20 mL，在水浴中浸泡45 min（或超聲提取45 min），過濾，定容至25 mL，置于-4 ?℃冰箱中備用。

1.3.2 咖啡堿合成途徑相關(guān)物質(zhì)含量的測定。采用高效液相色譜法測定咖啡堿合成途徑中間產(chǎn)物可可堿、1，7-二甲基黃嘌呤、茶堿和咖啡堿4種物質(zhì)含量[13]。色譜柱采用InertsiL-ODC C18（250.0 mm×4.6 mm，5 μm），35 ℃柱溫;流動相為甲醇/超純水=40/60，流速為0.4 mL/min，20 μL進樣量;在271 nm波長下檢測。

1.3.3 咖啡堿合成酶基因表達。

RNA提取采用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒;以總RNA為模板合成cDNA第1鏈;以cDNA為模板應(yīng)用SYBR Premix ExTaqTMII試劑盒進行熒光定量表達，咖啡堿合成酶基因（TCS）引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

以GADPH為內(nèi)參基因，每個樣品對照基因與測定基因分別設(shè)3個重復(fù)和1個陰性對照，反應(yīng)結(jié)束后觀察溶解曲線及擴增曲線，采用2-ΔΔCT法進行相對表達量計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析 采用Microsoft Excel 2013進行數(shù)據(jù)整理和圖表制作，采用Duncans新復(fù)極差法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 咖啡堿前體物質(zhì)含量的回歸方程 咖啡堿合成途徑中的主要物質(zhì)有1，7-二甲基黃嘌呤、可可堿、咖啡堿和茶堿。采用高效液相色譜法建立4種物質(zhì)標準樣品的回歸方程，4種物質(zhì)標準品混合溶液的分離圖譜見圖1。從圖1可以看出，咖啡堿合成途徑4種物質(zhì)的保留時間不同，其出峰先后順序分別為可可堿、1，7-二甲基黃嘌呤、茶堿和咖啡堿。

以4種物質(zhì)標準品溶液濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標進行線性回歸分析，這4種物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)均大于0.99，符合回歸方程要求，建立咖啡堿合成途徑中間物質(zhì)1，7-二甲基黃嘌呤、可可堿、咖啡堿和茶堿的回歸方程（表2）。

2.2 樣品提取方式對咖啡堿含量的影響

樣品制備和提取方法對茶葉咖啡堿含量有直接影響。由圖2可知，樣品烘干后咖啡堿含量顯著高于鮮樣，咖啡堿含量提高了98.4%～190.0%，其中75%乙醇超聲處理的咖啡堿含量最高，為7.549 μg/mg，這主要是由于烘干降低樣品的含水量，從而提高咖啡堿含量。

不同提取方式中，熱水結(jié)合超聲波處理的咖啡堿含量高于熱水浸提處理，乙醇結(jié)合超聲波處理的咖啡堿含量顯著高于乙醇浸提處理，這是由于超聲波處理加快樣品中細胞破裂有利于咖啡堿的提取。提取溶劑中，75%乙醇處理的咖啡堿含量顯著高于熱水處理，這是由于有機溶劑能促進咖啡堿溶解，從而提高咖啡堿提取效果。因此， 75%乙醇結(jié)合超聲波處理樣品能準確提取茶葉中咖啡堿。

2.3 水楊酸對烏龍茶咖啡堿含量的影響

烏龍茶樹噴施水楊酸能夠提高茶葉咖啡堿含量。由圖3可知，隨著水楊酸濃度的增加，茶葉咖啡堿含量出現(xiàn)先升高后下降的變化，且水楊酸處理的咖啡堿含量均顯著高于對照;2.0 mmol/L水楊酸條件下，咖啡堿含量達到最大值，比對照增加29.3%;隨后咖啡堿含量緩慢下降;4.0 mmol/L水楊酸時，咖啡堿含量降為最低值，但仍高于對照。因此，水楊酸對咖啡堿合成起到明顯的促進作用。

2.4 水楊酸對烏龍茶咖啡堿合成酶基因表達的影響

咖啡堿合成酶（TCS）是茶樹中咖啡堿合成途徑的關(guān)鍵酶基因。由圖3可知，噴施水楊酸后，茶樹的咖啡堿合成酶基因相對表達量顯著提高;隨著水楊酸濃度的增加，TCS基因相對表達量呈先上升后下降的趨勢，2 mmol/L水楊酸條件下， TCS基因相對表達量達到最大值，比對照增加2.18倍;隨后TCS基因表達量下降;4 mmol/L水楊酸條件下，TCS基因相對表達量降為最低值，但比對照增加98.06%，且顯著高于對照。

2.5 水楊酸對咖啡堿合成途徑中間物含量的影響

可可堿、1，7-二甲基黃嘌呤和茶堿是咖啡堿合成途徑中間產(chǎn)物，是咖啡堿的前體物質(zhì)，直接影響咖啡堿的生成。由圖5可知，咖啡堿合成途徑前體物質(zhì)含量的變化與咖啡堿含量變化基本一致。水楊酸處理均顯著提高可可堿、1，7-二甲基黃嘌呤和茶堿含量;隨著水楊酸濃度逐漸升高，咖啡堿合成途徑3種前體物質(zhì)呈先升高后下降的趨勢;1.0 mmol/L水楊酸條件下，3種前體物質(zhì)可可堿、1，7-二甲基黃嘌呤和茶堿含量均達到最大值，分別比對照增加60.89%、53.51%和498.69%;隨后這3種前體物質(zhì)含量均逐漸降低;水楊酸濃度為4.0 mmol/L時，3種前體物質(zhì)含量降為最低值，但仍顯著高于對照。

3 結(jié)論與討論

水楊酸是植物抗逆的內(nèi)源信號物，可以激活植物的防御反應(yīng)，誘導植物體內(nèi)某些次生代謝產(chǎn)物的生物合成[5]。植物中高水平的水楊酸可誘導香豆素、類胡蘿卜素等多種羥基苯甲酸和羥基苯丙烯酸衍生物的合成[14]。水楊酸處理丹參細胞可增加丹參細胞里酚類物質(zhì)，也可提高超氧化物歧化酶、過氧化物酶和羥基苯丙酮酸雙氧化酶等酶的活性[15]。添加低濃度水楊酸提高人參皂苷和糖苷的合成量[16-17]。在黃芩愈傷組織繼代培養(yǎng)中添加50 μmol/L水楊酸時，黃芩苷含量提高1.63 倍[18]。該研究中噴施2.0 mmol/L水楊酸可顯著促進茶樹咖啡堿含量的增加，而較高濃度的水楊酸對咖啡堿的生成不明顯，這與前人的研究報道基本一致。因此，葉面噴施適宜濃度的外源水楊酸（2.0 mmol/L）可以提高茶樹咖啡堿含量，有效促進咖啡堿積累。

水楊酸還可以誘導植物體內(nèi)某些次生代謝產(chǎn)物的生物合成[19]?？Х葔A作為茶樹中重要的次生代謝產(chǎn)物，其體內(nèi)合成也受到咖啡堿合成代謝途徑基因表達的調(diào)控[12，20]。Maluf 等[21]發(fā)現(xiàn)高咖啡堿含量的果實中咖啡堿合成酶表達量較高，低咖啡堿含量的果實中咖啡堿合成酶表達量較低。李金等[22]比較茶樹咖啡堿合成途徑中TCS1、TIDH、SAMS的基因表達量差異與咖啡堿含量的相關(guān)性后，發(fā)現(xiàn)TCS1對茶樹咖啡堿的合成起到重要作用。鄧威威等[23]克隆出茶樹咖啡堿合成酶基因，構(gòu)建了TCS1原核表達質(zhì)粒，同時成功制備了抗TCS1的多克隆抗體。該研究中咖啡堿合成酶（TCS1）對咖啡堿合成代謝起到主要作用，2.0 mmol/L水楊酸有利于提高咖啡堿合成途徑酶基因的表達。目前，雖然克隆了部分參與咖啡堿合成代謝的關(guān)鍵酶基因，但是咖啡堿代謝途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還不清楚;水楊酸等外源物對鐵觀音咖啡堿代謝調(diào)控機理仍有待進一步研究。

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