莊晶玲 ，于洋，楊麗麗，張金宏，靳艷*，馮斌*

1. 中國(guó)科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所（大連 116023）；2. 大連醫(yī)科大學(xué)（大連 116044）；3. 百瑞源枸杞股份有限公司（銀川 750200）

枸杞（Lycium chinenseMiller）是茄科植物，枸杞果實(shí)枸杞子是中國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源藥材，《中藥大辭典》記載枸杞子具有滋補(bǔ)肝腎、益精明目的功效[1]。枸杞子含有枸杞多糖[2]、黃酮、多酚[3]、類胡蘿卜素[4]等多種活性物質(zhì)，具有抗氧化、降血脂、抗衰老、保肝等生物活性[5]。玉米黃素二棕櫚酸酯（Zeaxanthin dipalmitate）是枸杞子中的最主要的類胡蘿卜素，國(guó)內(nèi)枸杞研究及產(chǎn)業(yè)界又將玉米黃素二棕櫚酸酯稱為枸杞紅素。枸杞紅素是一種富含氧的類胡蘿卜素，分子結(jié)構(gòu)上含多個(gè)不飽和雙鍵，分子式為C72H116O4（CAS號(hào)：144-67-2），其化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。枸杞紅素經(jīng)皂化反應(yīng)后可脫去二棕櫚酸生成玉米黃素（Zeaxanthin），玉米黃素和葉黃素是人類視網(wǎng)膜上的主要色素。玉米黃素具有強(qiáng)抗氧化性，大量的人體試驗(yàn)研究結(jié)果表明，補(bǔ)充葉黃素和玉米黃素可改善視覺(jué)系統(tǒng)處理速度[6]、降低老年黃斑變性風(fēng)險(xiǎn)[7]，因此玉米黃素具有明確的改善視健康的功效。玉米黃素遇光、熱、酸等不穩(wěn)定，與游離的玉米黃素相比酯化玉米黃素——枸杞紅素則較為穩(wěn)定，因此枸杞子中的枸杞紅素更易于發(fā)揮藥效[8]。

圖1 枸杞紅素的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

枸杞子是含有枸杞紅素含量最高的植物之一[9]，枸杞子的益精明目功效與其富含枸杞紅素密切相關(guān)。Weller等[9]最早利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS）分析紅辣椒、錦燈籠、枸杞子等植物中枸杞紅素及玉米黃素，其中枸杞子中的枸杞紅素含量最高，為0.082 4%。Peng等[10]用高效液相色譜法測(cè)定不同品種的枸杞子中枸杞紅素，其含量在0.03%～0.5%之間。Zhao等[11]將枸杞子中的枸杞紅素皂化為玉米黃素，用高效液相色譜法測(cè)定不同品種的枸杞子中玉米黃素，其含量在0.006%～0.15%之間。雖然HPLC被用于枸杞子中枸杞紅素含量的測(cè)定，但是現(xiàn)有的研究并沒(méi)有系統(tǒng)研究品種、加工方式、產(chǎn)地等因素對(duì)枸杞紅素的影響。

寧夏是中國(guó)枸杞子地道產(chǎn)區(qū)，也是中國(guó)枸杞的主要種植基地，寧夏的枸杞產(chǎn)量約占全國(guó)枸杞產(chǎn)量的20%，因此寧夏枸杞在中國(guó)枸杞產(chǎn)業(yè)中占據(jù)重要的地位。枸杞紅素含有極強(qiáng)的抗氧化性，使其極易受環(huán)境因素影響[12]。枸杞紅素中存在共軛雙鍵，即含有長(zhǎng)鏈不飽和雙鍵結(jié)構(gòu)體系，使枸杞紅素極其不穩(wěn)定[13]，其對(duì)溫度等環(huán)境因素特別敏感容易異構(gòu)化或降解。試驗(yàn)將以寧夏枸杞為對(duì)象，系統(tǒng)研究枸杞子品種、產(chǎn)地、等級(jí)及加工方式對(duì)枸杞子中枸杞紅素含量的影響，并研究枸杞紅素的穩(wěn)定性，為篩選富含枸杞紅素的枸杞子，以及保存枸杞紅素提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞樣品（百瑞源枸杞股份有限公司）；枸杞紅素標(biāo)準(zhǔn)品（純度95%，法國(guó)Extrasynthese，ZES-0309S）；甲醇、二氯甲烷、乙腈（均為色譜純，天津科密歐）；正己烷、乙酸乙酯、乙醇（均為分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

日立5000高效液相色譜系統(tǒng)（含四元色譜泵、雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、柱溫箱和自動(dòng)進(jìn)樣器，日本Hitachi公司）；AX120電子天平（日本Shimadzu公司）；Allegra 64R高速離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）；離心濃縮機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；JYL-D050料理機(jī)（九陽(yáng)股份有限公司）；Scientz-II D超聲細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司）；Milli-Q超純水一體機(jī)（美國(guó)Millipore公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；手套箱式隔離器（美國(guó)VAC公司）。

1.3 色譜條件

高效液相色譜法參考文獻(xiàn)[9]并稍作修改。色譜柱：YMC-carotenoid（C30）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μmol/L）；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相A為甲醇-乙腈-水（81︰14︰5，V/V），流動(dòng)相B為二氯甲烷；梯度洗脫條件：0～3 min，84%A；3～23 min，83%～45% A；23～38 min，45%～25%A；38～43 min，25%～25% A；43～45 min，25%～84%A；檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取枸杞紅素標(biāo)準(zhǔn)品，用高效液相色譜的流動(dòng)相A-流動(dòng)相B（1︰1，V/V）溶液溶解，配制成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.5 枸杞紅素提取方法

精確稱取10 g枸杞子，加5倍水于JYL-D050料理機(jī)中打碎，于8 000 g離心10 min，取沉淀冷凍干燥得到枸杞子粗渣。取1 g枸杞子粗渣，加入150 mL正己烷-乙醇混合液（2.6︰1，V/V），以200 r/min機(jī)械攪拌20 min，即枸杞子提取液，冷凍干燥枸杞子提取液，即為枸杞紅素提取物。樣品用0.22 μmol/L有機(jī)相濾膜過(guò)濾后用于高效液相色譜分析。

1.6 枸杞紅素提取物穩(wěn)定性樣品的制備

冷凍干燥枸杞子提取液，即為枸杞紅素提取物，用于枸杞紅素提取物穩(wěn)定性的研究。將枸杞紅素提取物，分別在空氣環(huán)境和氬氣環(huán)境保存考察穩(wěn)定性?？諝猸h(huán)境的樣品分別保存于室溫和4 ℃環(huán)境；氬氣保護(hù)的樣品在手套箱氬氣環(huán)境中將氣體置換為氬氣并密封，分別保存于室溫和4 ℃環(huán)境。4組樣品分別于0，3，9，15，60和120 d測(cè)定其枸杞紅素殘余率。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜法分析枸杞紅素

利用1.3小節(jié)的色譜條件分別分析枸杞紅素標(biāo)準(zhǔn)品及特級(jí)寧杞7號(hào)枸杞子提取液，色譜圖分別見(jiàn)圖2。枸杞紅素標(biāo)準(zhǔn)品在保留時(shí)間29.99 min處的峰為枸杞紅素，枸杞子提取液的色譜圖中主要峰為保留時(shí)間29.98 min的峰，其保留時(shí)間與枸杞標(biāo)準(zhǔn)品基本一致，初步推斷該峰為枸杞紅素。

為進(jìn)一步確認(rèn)圖2（B）中枸杞子提取液中的主峰為枸杞紅素，對(duì)該峰在波長(zhǎng)300～600 nm范圍內(nèi)掃描，將枸杞子提取液的主峰的紫外吸收譜與枸杞紅素標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收譜做比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)圖3。可見(jiàn)在波長(zhǎng)300～600 nm范圍內(nèi)，枸杞子提取液中的主成分與枸杞紅素標(biāo)準(zhǔn)品吸光度特征一致，因此可認(rèn)為枸杞子提取液中保留時(shí)間29.98 min的峰為枸杞紅素。

分別配制質(zhì)量濃度5，10，25，50和100 μg/mL的枸杞紅素標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行高效液相色譜分析，利用峰面積與枸杞紅素濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為Y=61 887X-80 482，R2=0.999 5，枸杞紅素在5～100 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，定量限LOQ=0.6 mg/kg。

2.2 不同品種的枸杞子中枸杞紅素含量

寧杞7號(hào)和寧農(nóng)杞2號(hào)是寧夏種植面積較大的2個(gè)枸杞品種，利用高效液相色譜法測(cè)定同產(chǎn)于寧夏中寧的寧杞7號(hào)和寧農(nóng)杞2號(hào)的枸杞子中的枸杞紅素含量，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，在產(chǎn)地、等級(jí)和干燥方式相同的情況下，寧杞7號(hào)的枸杞紅素含量幾乎是寧農(nóng)杞2號(hào)的枸杞紅素含量的兩倍，為2.74±0.11 mg/g。

圖2 枸杞紅素標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖（A）與枸杞子提取液的色譜圖（B）

圖3 枸杞紅素標(biāo)準(zhǔn)品與枸杞子提取液的紫外吸收譜圖

表1 不同品種枸杞子中枸杞紅素含量（n=3）

2.3 產(chǎn)地對(duì)枸杞子中枸杞含量的影響

近年來(lái)枸杞種植的產(chǎn)業(yè)不斷擴(kuò)大，枸杞的種植地從寧夏中寧擴(kuò)大到寧夏其他地區(qū)乃至其他省份。比較產(chǎn)于寧夏中寧、賀蘭山、紅寺堡及青海省的寧杞7號(hào)枸杞子中的枸杞紅素含量，結(jié)果見(jiàn)表2。在其他條件相同的情況下，產(chǎn)于寧夏中寧的枸杞子中枸杞紅素含量顯著高于其他3個(gè)產(chǎn)地，寧夏紅寺堡和青海產(chǎn)地的枸杞子的枸杞紅素含量相當(dāng)。從枸杞紅素含量的角度來(lái)看，寧夏中寧地區(qū)作為枸杞的主產(chǎn)地具有天然的優(yōu)勢(shì)。

表2 不同產(chǎn)地的枸杞子中枸杞紅素含量（n=3）

2.4 等級(jí)對(duì)枸杞子中枸杞紅素含量的影響

以寧杞7號(hào)為對(duì)象，研究不同等級(jí)的枸杞子中枸杞紅素的含量。枸杞子等級(jí)是百瑞源枸杞股份有限公司按照GB/T 18672—2014進(jìn)行分級(jí)提供，結(jié)果見(jiàn)表3。在產(chǎn)地、干燥方式相同的情況下，特級(jí)枸杞子中枸杞紅素含量最高為2.74±0.11 mg/g，隨著等級(jí)下降枸杞紅素含量逐漸降低，乙級(jí)的枸杞中枸杞紅素僅1.64±0.09 mg/g。

表3 不同等級(jí)的枸杞子中枸杞紅素含量（n=3）

2.5 干燥方式對(duì)枸杞子中枸杞紅素含量的影響

新鮮枸杞不易保存，干燥加工是枸杞子最關(guān)鍵的加工步驟。傳統(tǒng)的自然曬干方式仍被廣泛使用，近年來(lái)隨著技術(shù)發(fā)展，熱風(fēng)干燥、真空干燥等技術(shù)也被逐漸應(yīng)用于枸杞子加工中[11]。以寧夏中寧產(chǎn)甲級(jí)的寧杞7號(hào)枸杞子為對(duì)象，研究熱風(fēng)干燥、真空干燥和自然曬干等幾種干燥方式對(duì)枸杞子中枸杞紅素的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果可見(jiàn)，熱風(fēng)干燥枸杞子中枸杞紅素含量最高，為2.59±0.051 mg/g；自然曬干的枸杞子中的枸杞含量最低，為1.97±0.040 mg/g。

表4 不同干燥方式對(duì)枸杞子中枸杞紅素含量的影響（n=3）

2.6 枸杞紅素提取物穩(wěn)定性

按照1.6小節(jié)制備枸杞紅素提取物，制備成保存于隔絕空氣的氬氣密封袋和暴露于空氣的樣品，2種樣品分別保存于4 ℃冰箱和室溫，利用HPLC檢測(cè)保存過(guò)程中枸杞紅素的殘留率。圖4和圖5分別為未經(jīng)保護(hù)的空氣和氬氣保護(hù)環(huán)境下枸杞紅素的殘余率變化規(guī)律。由圖4可見(jiàn)，在室溫環(huán)境下，暴露于空氣120 d的枸杞紅素殘余率約為71.19%，而保存于4 ℃環(huán)境下的枸杞紅素樣品殘余率為85.48%，說(shuō)明低溫可顯著改善長(zhǎng)期保存的枸杞紅素的穩(wěn)定性，特別是對(duì)于暴露于空氣中的樣品，這種改善尤其明顯。

由圖5可知，氬氣保護(hù)下穩(wěn)定性好于空氣中樣品，經(jīng)過(guò)120 d后枸杞紅素均在83%以上，說(shuō)明如果隔絕空氣氬氣保存也可改善枸杞紅素的穩(wěn)定性。枸杞紅素提取物中枸杞紅素在前15 d枸杞紅素的穩(wěn)定性變化較大，15 d后逐漸趨于穩(wěn)定。枸杞紅素提取物最佳的保存條件是隔絕空氣低溫保存，以這種方式放置120 d后的枸杞紅素殘余率約87.41%，因此這種方式可作為枸杞紅素提取物的一種保存方式。

圖4 空氣環(huán)境下枸杞紅素的殘余率

圖5 氬氣環(huán)境下枸杞紅素的殘余率

3 結(jié)論與討論

建立高效液相色譜法分析枸杞子中枸杞紅素的方法，研究枸杞子品種、產(chǎn)地、等級(jí)、干燥方式等因素對(duì)枸杞紅素含量的影響。

比較了寧夏中寧產(chǎn)的寧杞7號(hào)和寧農(nóng)杞2號(hào)2個(gè)品種枸杞子中的枸杞紅素含量，寧杞7號(hào)的枸杞子的枸杞紅素含量明顯高于寧農(nóng)杞2號(hào)枸杞子，為2.74±0.11 mg/g。比較產(chǎn)于寧夏中寧、賀蘭山、紅寺堡及青海省的寧杞7號(hào)枸杞子中的枸杞紅素量，結(jié)果顯示寧夏中寧的枸杞子中枸杞紅素含量最高，雖然枸杞紅素并不是道地藥材的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，但枸杞紅素含量的結(jié)果說(shuō)明寧夏中寧的氣候及地理位置非常有利于枸杞子中枸杞紅素的積累。比較特級(jí)、甲級(jí)、乙級(jí)寧杞7號(hào)枸杞子的枸杞紅素含量，結(jié)果顯示枸杞紅素含量與枸杞子等級(jí)密切相關(guān)，特級(jí)枸杞子中枸杞紅素含量最高，隨著等級(jí)下降枸杞紅素含量逐漸降低。比較經(jīng)過(guò)熱風(fēng)干燥、真空干燥、自然曬干處理的寧杞7號(hào)枸杞子中的枸杞紅素含量，熱風(fēng)干燥枸杞子中枸杞紅素含量最高，自然曬干的枸杞子中枸杞紅素含量最低，兩者相差近1倍，說(shuō)明傳統(tǒng)的曬干模式并不利于枸杞紅素的穩(wěn)定。由于枸杞紅素對(duì)光、熱、氧氣等因素敏感，自然曬干時(shí)光照、溫度、時(shí)間等條件不可控，導(dǎo)致部分枸杞紅素降解，因此現(xiàn)代溫度時(shí)間可控的干燥方式更有益枸杞子中枸杞紅素的保存。

枸杞紅素作為枸杞中主要的類胡蘿卜素，擁有良好的抗氧化性，主要原因是其含有較長(zhǎng)的共軛雙鍵和豐富的活性基團(tuán)[12]，從而發(fā)揮良好的清除自由基的能力，但同時(shí)對(duì)于環(huán)境變化的不穩(wěn)定性也顯著增加。溫度是一個(gè)影響枸杞紅素穩(wěn)定性的重要因素，隨著溫度增加枸杞紅素的降解也隨之增加，并且放置時(shí)間越久，氧化時(shí)間越久，也會(huì)使枸杞紅素的穩(wěn)定性下降，因此在儲(chǔ)存枸杞紅素凍干粉的時(shí)候，應(yīng)盡量避光、低溫、隔絕空氣。于4 ℃、隔絕空氣的情況下保存120 d，枸杞紅素殘余率為87.41%，這種方式可作為枸杞紅素提取物的一種保存方式。

越來(lái)越多的證據(jù)顯示枸杞紅素在眼健康、護(hù)肝[13]等方面的藥用價(jià)值，然而天然植物中枸杞紅素的含量是制約枸杞紅素制備產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵因素。即使是枸杞紅素含量最高的植物——枸杞子，其枸杞紅素含量?jī)H0.27%，因此從枸杞子中制備枸杞紅素顯然不具備商業(yè)可行性。但是枸杞多糖、多酚等功能因子的活性已被證實(shí)并具備產(chǎn)業(yè)化條件，將枸杞紅素的制備與枸杞多糖、多酚等物質(zhì)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)枸杞子的綜合利用，不僅實(shí)現(xiàn)枸杞子高值化利用，而且可提供功效明確的功能食品。