張超 ，談火群，羅曉東，莊遠(yuǎn)杯 ，謝華松，張聲源 *

1. 嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院（梅州 514031）；2. 梅州市工程技術(shù)研究中心（梅州 514031）

人在進(jìn)行生命活動(dòng)時(shí)不斷產(chǎn)生的活性氧（ROS）和自由基會(huì)使細(xì)胞和機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)（oxidative stress），這是引起衰老和產(chǎn)生許多疾病產(chǎn)生的重要因素[1]。正常生理代謝活動(dòng)中，人體自身的抗氧化系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)消滅自由基，但當(dāng)機(jī)體長(zhǎng)期處于氧化壓力狀態(tài)時(shí)，便會(huì)面臨諸多慢性炎性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、高血壓、肥胖、動(dòng)脈粥樣硬化、肌肉萎縮等疾病[2]。在這種情況下，及時(shí)補(bǔ)充抗氧化劑來(lái)清除過(guò)多的自由基，緩解自由基對(duì)機(jī)體造成的損傷，對(duì)于許多自由基引起的衰老和相關(guān)疾病都能夠很好地預(yù)防。生活中大多的化學(xué)合成抗氧化劑，如二丁基羥基甲苯（BHT）、丁基羥基茴香醚（BHA）等，雖然具有很好的抗氧化能力，但同時(shí)對(duì)人體也有一定的毒性和致癌作用[3]，故其在人體中并無(wú)應(yīng)用，只作為工業(yè)抗氧化防腐劑使用，加上天然抗氧化劑具有來(lái)源廣泛、抗氧化活性強(qiáng)、易吸收和安全性高等優(yōu)點(diǎn)，開(kāi)發(fā)天然抗氧化劑越來(lái)越受到關(guān)注。

N-亞硝基化合物是一種致癌性很強(qiáng)的化合物，已研究的近300種N-亞硝基化合物中，90%以上具有動(dòng)物致癌性，并證明N-亞硝基化合物可在體內(nèi)外由其前體物胺類(lèi)與硝酸鹽或亞硝酸鹽形成[4]。亞硝酸鹽是自然界中普遍存在的一類(lèi)含氮無(wú)機(jī)化合物，可作為食品添加劑應(yīng)用于肉制品中，起到護(hù)色、增色、增味、防腐等作用，但亞硝酸鹽是一把雙刃劍，為食品加工帶來(lái)效益的同時(shí)，也可因一次性攝入過(guò)量亞硝酸鹽引起中毒甚至死亡[5]。另外，亞硝酸鹽被人食用后，會(huì)在人體內(nèi)形成亞硝胺，而亞硝胺是一種強(qiáng)烈致癌物質(zhì)，會(huì)引起食道、胃、肝和大腸等部位的癌癥[6-8]。人體從食物中攝入的亞硝胺量極少，但是形成亞硝胺的前體物質(zhì)亞硝酸鹽和胺類(lèi)卻大量存在于硝酸鹽或亞硝酸鹽含量較高的腌制肉制品、泡菜及變質(zhì)的蔬菜等食物中，以及產(chǎn)生于食物在體內(nèi)的代謝過(guò)程中[9]。胃是適合亞硝基化反應(yīng)的有利場(chǎng)所，人體攝入亞硝酸鹽和胺類(lèi)化合物后，兩者就會(huì)在胃內(nèi)進(jìn)行亞硝化反應(yīng)，直接生成亞硝胺，所以阻斷或減少亞硝胺的生成是預(yù)防亞硝胺所致癌癥的有效途徑[10]。

紅絲線(xiàn)是爵床科觀(guān)音草屬植物觀(guān)音草（Peristrophe bɑphicɑ（Spreng）Bremek）的干燥全草，又名野靛青、山藍(lán)、紅蘭草、青絲線(xiàn)等，主要分布于印度、東南亞國(guó)家及中國(guó)南部，為廣西壯族自治區(qū)特色食品——紅蘭酒的原料，也是東南亞及我國(guó)西南少數(shù)民族傳統(tǒng)的食用染料植物，全草有清肺熱、涼血止血、活血化瘀、消腫止痛等作用，作為一種民間草藥，其常用于止咳祛痰和治咯血、跌打損傷等癥[11]。據(jù)《常用中草藥手冊(cè)》記載，紅絲線(xiàn)具有“淡涼，散瘀、止血，治跌打淤腫、急性扭挫傷、內(nèi)傷咳血”的作用。《全國(guó)中草藥匯編》中對(duì)紅絲線(xiàn)的描述為：“甘、淡、涼。清肺止咳，散瘀止血。治肺結(jié)核咯血、肺炎、糖尿病、跌打損傷腫痛。”多項(xiàng)研究表明，紅絲線(xiàn)具有多種活性成分，如生物堿、萜類(lèi)、有機(jī)酸、黃酮類(lèi)化合物、揮發(fā)油、脂肪族化合物及微量元素等化學(xué)物質(zhì)[12-14]。紅絲線(xiàn)是梅州客家地區(qū)常見(jiàn)藥膳原料，口感鮮美，具清肺瀉火、消腫解毒等多種功效，民間多用于小兒高熱，驚風(fēng)等；其藥食兩用的科學(xué)內(nèi)涵至今尚未明確，嚴(yán)重制約其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。

就國(guó)內(nèi)外來(lái)看，對(duì)紅絲線(xiàn)的研究集中于其化學(xué)成分及藥理活性、不同提取物、毒理學(xué)和生藥學(xué)研究等[15-18]，楊朝竣等[19]證實(shí)紅絲線(xiàn)中的色素具有較好的抗氧化活性，而對(duì)紅絲線(xiàn)抑制亞硝化作用的研究卻鮮見(jiàn)有報(bào)道。試驗(yàn)采用DPPH法、ABTS法和普魯士藍(lán)法評(píng)價(jià)紅絲線(xiàn)提取物不同溶劑萃取部位的抗氧化作用，并在模擬人體胃液的條件下采用鹽酸萘乙二胺法和α-萘胺法分別測(cè)定紅絲線(xiàn)提取物對(duì)亞硝酸鹽的清除率和對(duì)亞硝胺合成的阻斷率，從而對(duì)其抗氧化能力及抑制亞硝化作用進(jìn)行研究分析，以期為紅絲線(xiàn)的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅絲線(xiàn)干品于2018年5月購(gòu)自梅州市梅江區(qū)，經(jīng)嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院張聲源副教授鑒定為爵床科觀(guān)音草屬植物觀(guān)音草（Peristrophe bɑphicɑ（Spreng）Bremek）的干燥全草，標(biāo)本存放于嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院天然藥物標(biāo)本館。

1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2, 2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）（美國(guó)Sigma公司）；亞硝酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、二甲胺、1-萘胺（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；維生素C（西隴科學(xué)有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；BT125D型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；N-1100V型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司）；WJX-A1000型高速多功能粉碎機(jī)（浙江省永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司）；WFT-203B三用紫外線(xiàn)分析儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；HH-2A恒溫水浴鍋（常州潤(rùn)華電器有限公司）。

1.3 樣品制備

取紅絲線(xiàn)干燥樣品2.0 kg粉碎后，90%乙醇溶液超聲提取3次（45 ℃，200 W，30 min），減壓濃縮后加水散開(kāi)成混懸液，依次加入石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取濃縮，分別制得紅絲線(xiàn)的石油醚部位24.7 g（P-P）、乙酸乙酯部位10.3 g（P-E）、正丁醇萃部位16.5 g（P-B）、水部位86.8 g（P-W）。

1.4 體外抗氧化作用研究

1.4.1 DPPH法

DPPH自由基清除能力測(cè)定參考文獻(xiàn)[20]，分別精密吸取100 μL不同質(zhì)量濃度的樣品和VC溶液，并分別加入于3.9 mL 1 mmol/mL DPPH無(wú)水乙醇溶液中，避光反應(yīng)20 min，以無(wú)水乙醇溶劑做空白對(duì)照，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)量其的吸光度（Ai）；測(cè)定3.9 mL 1 mmol/mL DPPH無(wú)水乙醇溶液與100 μL無(wú)水乙醇混合后在波長(zhǎng)517 nm處的吸光度（A0）；測(cè)定3.9 mL無(wú)水乙醇溶液與100 μL樣品溶液在波長(zhǎng)517 nm處的吸光度（Aj），每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次。根據(jù)式（1）計(jì)算各樣品對(duì)DPPH自由基的清除率。

1.4.2 ABTS法

ABTS自由基清除能力測(cè)定參考文獻(xiàn)[21]，將2.45 mmol/mL過(guò)硫酸鉀與7.0 mmol/mL ABTS溶液進(jìn)行體積1︰1混合后避光放置16 h制備得ABTS母液，用0.01 mol/mL磷酸緩沖溶液（pH 7.4）稀釋ABTS母液，得到在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度0.70±0.02的ABTS工作液。分別將100 μL不同質(zhì)量濃度的樣品和VC溶液加入3.9 mL ABTS工作液中，振蕩30 s，在室溫條件下放置10 min，在734 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度（Ai）。使用同樣方法在波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定3.9 mL ABTS工作液與100 μL無(wú)水乙醇混合后的吸光度（A0）。同法在波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定3.9 mL 0.01 mol/mL磷酸緩沖溶液與100 μL樣品溶液的吸光度（Aj），每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。根據(jù)式（2）計(jì)算各樣品對(duì)ABTS自由基的清除率。

1.4.3 普魯士藍(lán)法

普魯士藍(lán)法的測(cè)定參考文獻(xiàn)[22]，并做適當(dāng)修改。分別精密移取2.0 mL不同質(zhì)量濃度的樣品和VC溶液于10 mL試管中，再分別加入2.0 mL磷酸緩沖液（2.0 mol/mL，pH 6.6）和2.0 mL 1%鐵氰化鉀，搖勻，于50 ℃恒溫水浴20 min后取出急速冷卻，再分別加入2.0 mL 10%三氯乙酸溶液。將上述溶液離心10 min（6 000 r/min），取上清液2.0 mL，加入1.5 mL蒸餾水及0.5 mL 0.1% FeCl3混勻，靜置10 min后于波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定吸光度，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，吸光度越大，還原能力越強(qiáng)。

1.5 抑制亞硝化作用研究

1.5.1 鹽酸萘乙二胺法測(cè)定亞硝酸鹽清除率

鹽酸萘乙二胺法亞硝酸鹽清除率的測(cè)定參考文獻(xiàn)[23]，并做適當(dāng)修改。取不同質(zhì)量濃度的樣品和VC溶液1.0 mL于25 mL比色管中，分別加入pH 3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液2.0 mL、5 μg/mL亞硝酸鈉溶液2.0 mL，充分混勻后37 ℃水浴1 h，加入0.4%對(duì)氨基苯磺酸2.0 mL，混勻，靜置3～5 min，各加1.0 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液。定容靜置15 min后在波長(zhǎng)538 nm下測(cè)定吸光度（Ai），同時(shí)測(cè)定空白對(duì)照組的吸光度A0和樣品溶液對(duì)照組Aj，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。根據(jù)式（3）計(jì)算各樣品對(duì)亞硝酸鹽的清除率。

1.5.2α-萘胺法測(cè)定亞硝胺合成阻斷率

α-萘胺法測(cè)定亞硝胺合成阻斷率參考文獻(xiàn)[24]，并做適當(dāng)改動(dòng)。取不同質(zhì)量濃度的樣品和VC溶液5.0 mL于25 mL比色管中，分別加入pH 3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液10.0 mL、1 mmoL/L NaNO溶液1.0 mL、

21 mol/L二甲胺溶液1.0 mL，定容后37 ℃水浴1 h。取上述溶液1.0 mL于培養(yǎng)皿中，加入0.5% Na2CO3溶液0.5 mL，于紫外分析儀上用波長(zhǎng)254 nm紫外光照射15 min。取出后分別加入1%對(duì)氨基苯磺酸1.5 mL、0.1%α-萘胺1.5 mL和蒸餾水0.5 mL，搖勻后靜置15 min，在最大吸收波長(zhǎng)525 nm處測(cè)定吸光度（Ai），同時(shí)測(cè)定空白對(duì)照組的吸光度A0和樣品溶液對(duì)照組Aj，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次。根據(jù)式（4）計(jì)算各樣品對(duì)亞硝胺合成的阻斷率。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，通過(guò)Origin 8.5和SPSS 24.0進(jìn)行處理分析，計(jì)算IC50值，采用單因素方差法進(jìn)行顯著性分析，p＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抗氧化試驗(yàn)

2.1.1 對(duì)DPPH自由基的抑制作用

紅絲線(xiàn)不同溶劑萃取部位對(duì)DPPH自由基的清除率測(cè)定結(jié)果及IC50見(jiàn)圖1和表1。由圖1可知，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，紅絲線(xiàn)各萃取部位對(duì)DPPH自由基均具有一定程度的清除作用，清除率隨質(zhì)量濃度增大而增大，呈一定量效關(guān)系，對(duì)DPPH自由基的清除能力順序依次為P-E＞P-B＞P-W＞P-P。據(jù)表1可知，P-E清除DPPH自由基的IC50值最低（0.052 4±0.004）mg/mL，表明紅絲線(xiàn)清除DPPH自由基的活性物質(zhì)主要集中在乙酸乙酯部位。但紅絲線(xiàn)4個(gè)萃取部位對(duì)DPPH自由基的清除能力仍然弱于陽(yáng)性對(duì)照VC（IC50=0.04±0.001 mg/mL，p＜0.05）。

圖1 紅絲線(xiàn)各萃取部位對(duì)DPPH自由基清除能力的影響

表1 紅絲線(xiàn)各萃取部位清除DPPH自由基的IC50值

2.1.2 對(duì)ABTS自由基的抑制作用

紅絲線(xiàn)不同溶劑萃取部位對(duì)ABTS自由基的清除率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2和表2。由圖2可知，4個(gè)萃取部位對(duì)ABTS自由基的清除能力呈現(xiàn)量效關(guān)系，P-E對(duì)ABTS自由基的清除能力最強(qiáng)，P-B與P-W對(duì)ABTS自由基的清除能力接近，清除率由高到低依次為P-E＞P-B＞P-W＞P-P。由表2可知，P-E對(duì)ABTS自由基清除能力比其他3個(gè)極性要強(qiáng)，但4個(gè)萃取部位對(duì)ABTS自由基的清除能力仍然弱于陽(yáng)性對(duì)照VC（IC50=0.033±0.003 mg/mL，p＜0.05）。

圖2 紅絲線(xiàn)各萃取部位對(duì)ABTS自由基清除能力的影響

表2 紅絲線(xiàn)各萃取部位清除ABTS自由基的IC50值

2.1.3 對(duì)鐵離子的還原能力

通過(guò)還原力強(qiáng)弱評(píng)價(jià)樣品抗氧化作用，由圖3可知，P-E的鐵還原能力最強(qiáng)（578.812±32.344）mmol VC/g。紅絲線(xiàn)各提取物對(duì)鐵離子的還原能力順序依次為P-E＞P-B＞P-W＞P-P，P-E對(duì)鐵的還原能力顯著大于其他萃取部位，表明紅絲線(xiàn)對(duì)鐵還原能力的活性物質(zhì)主要集中在乙酸乙酯部位。

圖3 紅絲線(xiàn)各萃取部位對(duì)鐵還原能力的影響

2.2 體外抑制亞硝化作用結(jié)果

2.2.1 對(duì)亞硝酸鹽的清除能力

據(jù)圖4可知，在模擬人體胃液條件下，紅絲線(xiàn)4個(gè)萃取部位對(duì)亞硝酸鹽表現(xiàn)出一定程度的亞硝酸鹽清除作用，且清除率在試驗(yàn)濃度的范圍內(nèi)隨質(zhì)量濃度增大而增強(qiáng)，但不同萃取部位的清除能力存在較大差異，質(zhì)量濃度相同時(shí)（10 mg/mL），P-E對(duì)亞硝酸鹽的清除率超過(guò)80%，顯示出最強(qiáng)的亞硝酸鹽清除作用。由表3可知，各萃取部位清除亞硝酸鹽能力大小依次為P-E＞P-B＞P-W＞P-P，P-E清除亞硝酸鹽的IC50值為（2.590 9±0.130）mg/mL，遠(yuǎn)小于其他部位，表明4個(gè)萃取部位中乙酸乙酯部位對(duì)亞硝酸鹽的清除能力最強(qiáng)，其次是石油醚層，IC50值為（3.480±0.265）mg/mL，但仍大于陽(yáng)性對(duì)照VC（IC50=1.480 2±0.022，p＜0.05）。

圖4 紅絲線(xiàn)各萃取部位對(duì)亞硝酸鹽清除能力的影響

表3 紅絲線(xiàn)各萃取部位清除亞硝酸鹽的IC50值

2.2.2 亞硝胺合成的阻斷能力

紅絲線(xiàn)不同溶劑萃取部位對(duì)亞硝胺合成的阻斷率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5和表4。由圖5可知，模擬人體胃液條件下，阻斷率隨濃度呈正相關(guān)。在質(zhì)量濃度20 mg/mL，P-E和P-B對(duì)亞硝胺的阻斷率分別達(dá)到81.65%和77.19%，大于P-E（37.29%）和P-P（22.97%），表現(xiàn)出良好的亞硝胺合成阻斷作用。如表4所示，P-E和P-B的IC50最低，但仍大于陽(yáng)性對(duì)比VC，表明紅絲線(xiàn)阻斷亞硝胺合成的活性物質(zhì)主要集中在乙酸乙酯層和正丁醇層，但二者存在差異。

圖5 紅絲線(xiàn)各萃取部位對(duì)亞硝胺合成阻斷能力的影響

表4 紅絲線(xiàn)各萃取部位阻斷亞硝胺合成的IC50值

3 結(jié)論

試驗(yàn)首次對(duì)紅絲線(xiàn)的抗氧化、抑制亞硝化作用進(jìn)行較為系統(tǒng)的探究，將為紅絲線(xiàn)藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立、藥理活性研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)?？寡趸鸵种苼喯趸Y(jié)果顯示，紅絲線(xiàn)不同溶劑萃取部位均具有一定抗氧化能力和抑制亞硝化能力。綜合DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和鐵離子還原能力的試驗(yàn)結(jié)果，4個(gè)不同極性組分抗氧化活性大小為：P-E＞P-B＞P-W＞P-P，因此從整體上看，紅絲線(xiàn)萃取組分中，乙酸乙酯組分（P-E）的抗氧化能力最強(qiáng)。與此同時(shí)，綜合亞硝酸鹽的清除能力和亞硝胺合成阻斷能力2種體系評(píng)價(jià)結(jié)果，紅絲線(xiàn)不同極性組抑制亞硝化能力依次為P-E＞P-B＞P-W＞P-P，乙酸乙酯組分（P-E）有比較好的亞硝酸鹽清除作用。因此，可以針對(duì)抗氧化和抑制亞硝化作用評(píng)價(jià)的結(jié)果，對(duì)紅絲線(xiàn)做進(jìn)一步研究，為深入開(kāi)發(fā)這一梅州特色藥食兩用植物提供理論依據(jù)。